α-磷酸三钙/胶原复合体与自体骨骨修复能力比较

李佩祺，吴补领，高 杰，方一如，松本尚之，桥本典也，廖 文，6

（1.南方医科大学南方医院牙体牙髓病-国家临床重点专科；2.南方医科大学口腔医学院，广东广州510515；3.大阪齿科大学大学院齿科矫正学讲座；4.大阪齿科大学齿科东洋医学；5.大阪齿科大学齿科理工学；6.四川大学口腔医学国家重点实验室，四川成都610041）

α-磷酸三钙/胶原复合体与自体骨骨修复能力比较

李佩祺1，2，3，吴补领1，高 杰1，方一如4，松本尚之3，桥本典也5，廖 文3，6

（1.南方医科大学南方医院牙体牙髓病-国家临床重点专科；2.南方医科大学口腔医学院，广东广州510515；3.大阪齿科大学大学院齿科矫正学讲座；4.大阪齿科大学齿科东洋医学；5.大阪齿科大学齿科理工学；6.四川大学口腔医学国家重点实验室，四川成都610041）

目的：探讨α-磷酸三钙/胶原复合体修复大鼠头盖骨骨缺损能力。方法：选用8周龄SD大鼠28只，随机分为自体骨组（n=12）、α-磷酸三钙/胶原复合材料组（n=12）与空白组（n=4）。自体骨组和材料组于术后4、6、8周3个时间点各处死大鼠4只；空白组大鼠在8周全部处死。分别进行mirco-CT扫描分析，HE、TRAP和ALP染色，比较各组修复骨缺损效果。结果：8周时α-磷酸三钙/胶原复合物和自体骨的骨体积分数分别为（69.7±3.95）%和（42.475±4.38）%（P＜0.05）；随着时间延长，α-磷酸三钙/胶原复合材料逐渐被吸收，同时骨缺损亦逐渐修复；自体骨缺损部在6周后出现大量破骨细胞，大面积移植骨与新生骨被吸收，而α-磷酸三钙/胶原复合体修复骨缺损中较少发现破骨细胞。结论：α-磷酸三钙/胶原复合体具有较好骨缺损修复能力，且材料易于吸收。

临界性骨缺损；α-磷酸三钙/胶原复合体；自体骨

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2015，25（4）：223］

近年牙周组织再生诱导术（guided tissue regeneration，GTR）作为牙周炎患者牙槽骨再生治疗的一种有效方法，在临床中常与骨移植材料并用治疗大面积牙槽骨缺损［1］。其中，使用自体骨移植既可提供成骨细胞及促进其前体细胞黏附又不存在外来物质引起的免疫排斥反应，是骨修复治疗的黄金手段［2］。然而由于自体骨来源有限、易被吸收以及采集自体骨产生的一系列并发症等问题，使人们迫切需要开发理想的骨替代物［3］。已经证明，α-磷酸三钙（alpha-tricalcium phosphate，α-TCP）材料具有良好的骨引导能力，并且已在临床广泛应用。然而，临床使用也发现α-磷酸三钙材料易残留在缺损部位，从而引起炎症反应，影响骨愈合。本实验前期研究发现，α-磷酸三钙虽具有良好的骨再生诱导能力，但其骨组织改建时间长，较多材料残留在新生骨组织中［4］。作为骨组织的重要组成成分，胶原亦是一种理想的人工骨材料［5］，但胶原因机械强度低，降解吸收速度快，骨引导能力较差等问题影响其骨缺损修复效果［6］。有研究发现，胶原中加入人工骨材料可提高材料骨修复能力，并且加快材料降解速度［7］。关于骨诱导材料α-磷酸三钙与胶原联合应用的研究报道较少，本实验拟采用大鼠头盖骨临界性骨缺损模型，在α-磷酸三钙中加入易于分解吸收的胶原，探讨α-磷酸三钙/胶原复合体的骨缺损修复效果，从而为提高复合材料修复骨缺损的临床应用研究提供实验依据。

1　材料和方法

1.1材料准备及合成

首先将5 cm×5 cm大小α-磷酸三钙（孔隙率80%，空隙直径200 mm；Taihei Chemical，大阪，日本）粉碎为10～200 μm的多孔α-磷酸三钙颗粒，再由猪皮中提取胶原并经胃蛋白酶（Nippon Meat Packers，日本）处理；然后将α-磷酸三钙颗粒与胶原匀浆合成150 mg/mL α-磷酸三钙/胶原溶液，倒入塑料模具（9 mm×9 mm×1 mm）中，立即在-80℃下冷冻干燥24 h；冻干后的α-磷酸三钙/胶原复合体类似于海绵状结构，随后将其置于140℃真空中使其发生交联反应。制成的材料成白色海绵状，于扫描电子显微镜下可见胶原成网状交织于α-磷酸三钙周围（图1）。

图1　α-磷酸三钙/胶原复合体

1.2临界性骨缺损模型的建立

8周SD大鼠（清水动物实验中心，日本）28只，体质量（250～280）g；动物实验经大阪齿科大学动物实验委员会许可批准（动物实验许可号13-03031）。28只大鼠腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥钠（Somnopentyl，Kyoritus制药，日本）麻醉，头部用聚维酮碘消毒，脱毛备皮，用慢速骨钻于头盖骨中部形成一个9 mm×9 mm×1 mm骨缺损区。然后在28只大鼠中随机选取24只分为材料组和自体骨组（n=12）用于移植骨材料，剩余4只为空白对照组。材料组：放入α-磷酸三钙/胶原复合体材料作为实验组；自体组：将取出的自体骨骨片粉碎，放入缺损区作为对照组；空白对照组：不放入任何材料。所有大鼠中均用可吸收性GTR膜（Japan Gore-Tex Co，日本）覆盖手术缺损区（图2）。逐层严密缝合肌肉和皮肤。术后给予实验动物普鲁卡因青霉素（15万单位）肌肉注射（1次/d，共3d）。常规条件下喂养观察。材料组和自体骨组分别于术后4、6、8周3个时间点各处死大鼠4只，空白对照组于术后8周时处死全部大鼠。

1.3观察指标

术后第4、6、8周，采用大剂量戊巴比妥钠（120 mg/kg）处死动物并分离出头盖骨，40 mg/L多聚甲醛固定，Micro-CT（SMX-130CT，日本）扫描并拍摄头盖骨的三维图像（电压67 kV，电流62 μA）。利用RATOC分析软件（TRI/3D-BON，日本）计算缺损区的骨体积分数（bone volume/total volume，BV/TV）、骨密度（bone mineraldensity，BMD）、骨矿含量分数（bone mineral content/total volume，BMC/TV）来评价骨生成情况；将标本用川本法［8］制成非脱钙骨切片，并行苏木精伊红染色（HE）抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、碱性磷酸酶（ALP）染色，显微镜下观察并拍照。

1.4统计学分析

2　结果

2.1Micro-CT观察结果

4周时，自体骨组：纵面图可见骨缺损边界尚清晰，埋入的自体骨上可见新生骨长成；横断面图可见植入的自体骨散布于缺损部组织中，骨碎片周围可见低密度软组织影像。材料组：纵面图可见材料部分降解，骨缺损边界清晰；横断面可见α-磷酸三钙/胶原复合体密度低于周围骨组织，材料中可见少量红色高密度骨影像，提示此处新骨生成。

6周时，自体骨组：纵面图可见缺损部骨组织生成，骨缺损面积减少，新生骨密度接近于周围骨组织，不能清晰分辨骨缺损边缘及植入自体骨材料；横断面图可见缺损部植入的自体骨相互连接形成骨片，骨缺损低密度影像面积减少。材料组：纵面图可见骨缺损面积减少，材料中有明显骨生成影像；横断面图可见材料中高密度新生骨影像进一步增大。

8周时，自体骨组：纵面图可见骨缺损面积增大，出现明显的骨吸收现象，中心部有少量骨质残留；横断面可见高密度骨影像减少，低密度软组织影像面积增大。材料组：纵面图像未见明显骨吸收现象，缺损部大部分被新生骨修复。空白组骨缺损只见边缘少量骨生成（图3）。

图2　临界性骨缺损建立

图3　4、6、8周自体骨组及α-磷酸三钙/胶原复合体材料组Micro-CT结果

2.2 Micro-CT骨计量分析结果

经Micro-CT扫描分析显示，8周时材料组和自体骨组的BV/TV分别为69.70%和42.47%，两组相比有统计学差异（P＜0.05）；且两组间的BMD、BMC/TV值相比均有统计学差异（P＜0.05）。但4、6周时，材料组和自体骨组的BV/TV、BMD、BMC/TV值相比无统计学差异（P＞0.05）（表1）。

表1　自体骨组和α-磷酸三钙/胶原复合体材料组缺损区骨计量统计分析结果 （±s）

表1　自体骨组和α-磷酸三钙/胶原复合体材料组缺损区骨计量统计分析结果 （±s）

骨计量 4周（n=4）6周（n=4）8周（n=4）自体骨组材料组t P 自体骨组材料组t P 自体骨组材料组t P BV/TV（%）51.02±5.9648.90±5.940.500.3268.35±3.7762.15±8.751.300.1242.47±4.3869.70±3.94-9.230.00 BMD（mg/cm3）425.47±44.89448.92±65.80.590.29445.10±84.64511.92±142.310.810.23372.02±11.75458.67±80.582.130.04 BMC/TV（mg/cm3）191.25±4.68195.25±40.920.190.43281.05±44.76293.77±123.830.190.43151.30±22.99221.95±49.732.310.03

2.3组织学观察结果

4周时，HE染色结果显示自体骨及α-磷酸三钙/胶原复合体被纤维结缔组织包绕，α-磷酸三钙/胶原复合体中心可见新生骨结节；ALP染色可见自体骨组与材料组均可见骨缺损部材料周边ALP高表达，显示植入材料周围有大量活跃的成骨细胞分泌大量骨基质参与骨缺损修复；植入的α-磷酸三钙/胶原复合体材料与自体骨部分降解吸收，两组TRAP染色只见少数的破骨细胞。

6周时，HE染色可见材料组和自体骨组均出现较多新生骨，骨小梁之间形成骨髓腔；ALP染色显示材料组中ALP表达较自体骨组强，成骨细胞在材料组中更为活跃；同时，TRAP染色显示此时自体骨组新生骨骨髓腔中出现大量破骨细胞，并形成吸收陷窝，而材料组新生骨中只见少数破骨细胞。

8周时，HE染色显示自体骨组中，移植自体骨及其周边新生骨多数被吸收，周围纤维结缔组织长入吸收后的骨陷窝中；材料组中未见α-磷酸三钙/胶原复合体材料残留，新生骨与缺损周边骨界限难以分辨；空白组骨缺损边缘可见少量骨生成，缺损大部分被纤维结缔组织充填。TRAP染色显示自体骨组可见大量破骨细胞，骨吸收活跃；材料组只见少数破骨细胞，未见明显骨吸收现象（图4～6）。

图4　4、6、8周时自体骨组和材料组HE染色结果（箭头示局部图拍摄位置，×10）

图6　4、6、8周时自体骨组和材料组TRAP染色结果（×10）

3　讨论

磷酸三钙材料因具有良好的骨传导性、生物相容性、可吸收性、炎症排斥反应少及其多孔结构利于血管生成而被广泛应用于临床骨缺损修复［9］。磷酸三钙材料主要分为低温β相（β-TCP）和高温α相（α-TCP），虽然具有相同的化学组成，但其分子结构不同［10］。β-TCP在烧结温度上较α-TCP低，易于溶解吸收，但硬度和塑形性较差。α-TCP硬度高，骨修复效果较好［11］，但降解速度慢，易于残留及难于塑形［12］。为了提高磷酸三钙材料骨修复效率，我们选用硬度较高的α-TCP与胶原混合形成α-磷酸三钙/胶原复合体材料，利用胶原较易分解吸收、弹性较好、易于塑形及利于成骨细胞黏附［13］等特点提高α-磷酸三钙材料的骨修复性能。本实验组在前期研究中比较不同浓度磷酸三钙/胶原比材料（20、50、100、200 mg/mL）的骨修复效果时发现，磷酸三钙含量与材料硬度及骨修复效果成正比，但与材料弹性及塑形性成反比［14］。因此，本实验选用的α-磷酸三钙/胶原比为150 mg/mL，具有较高的磷酸三钙含量，且材料硬度及塑形性较好。当今国内外磷酸三钙胶原复合体的研究大多集中于β-磷酸三钙/胶原复合体材料，而对α-磷酸三钙/胶原复合体的研究较少。我们前期研究发现，α-磷酸三钙/胶原复合材料能在6周内完全修复非临界性缺损骨缺损且不残留于骨组织中［15］。然而，α-磷酸三钙/胶原复合体能否修复较大的临界性骨缺损仍是一个未知数。

由于解剖因素，头盖骨缺损不易感染，成骨影响因素相对较少，易于分析观察，因此本实验选用了大鼠头盖骨9 mm×9 mm×1 mm的临界性骨缺损模型。自体骨为粉碎后的缺损区骨片，骨碎片量较为充足，可完全覆盖缺损区。同时，α-磷酸三钙/胶原复合体大小与自体骨相同，在湿润状况下与粉碎后的新鲜自体骨重量基本一致。我们使用Micro-CT追踪观察骨组织生长情况，并且通过获取TRAP、ALP非脱钙组织切片来观察成、破骨细胞形态以评价缺损区骨代谢状况，结果显示，6周时CT可见骨缺损区大量新生骨生成，材料组中可见大量散在高密度骨影像；8周时CT观察已完全愈合，组织切片可见材料与新生骨间无明显纤维组织间隙，成骨性能良好。自体骨组在4～6周表现出良好的成骨能力，但在8周时组织中出现大量的破骨细胞引起较大面积骨吸收，极大影响了骨修复效果。提示，α-磷酸三钙与胶原材料混合使用后能较快实现骨生成及提高材料降解率；在新骨完成了结构和功能重建后，该复合材料可完全被骨组织替代。在组织切片中，8周骨缺损区可见复合材料基本完全吸收，新生骨几乎完全修复骨缺损，说明α-磷酸三钙/胶原复合体材料的降解速度与新生骨生成速度相适应。同时该材料具有类似自然骨的多孔结构，这种结构利于细胞和血管的生长及成骨基质的沉积。

本实验通过大鼠体内α-磷酸三钙/胶原复合体材料修复临界骨缺损表明，磷酸钙盐材料与胶原复合体材料混合使用后具有适宜于骨生长修复的降解速度，能较快形成新生骨组织，修复较大的骨缺损而成为自体骨替代材料。同时提示在生物材料研究中，不同的材料混合使用可实现优点互补，进一步提高材料性能。然而，本实验两种材料混合后的硬度及弹性模量有待进一步检测，混合后的材料可能进一步降低材料前期负重的能力，从而影响材料的应用。同时，在实际的牙槽骨骨缺损环境中，材料的分解速度是否会进一步加快，是否会对周围组织产生影响，临床骨材料修复效果是否依然良好成为我们下一步实验希望解决的问题。

致谢：感谢大阪齿科大学齿科理工学讲座的大力支持和协作

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Alpha-tricalcium phosphate/atelocollagen sponge composite versus autogenous bone for bone repair efficacy

LI Pei-qi*，WU Bu-ling，GAO Jie，FANG Yi-ru，MATSUMOTO Naoyuki，HASHIMOTO Yoshiya，LIAO Wen
（*Department of Stomatology，Nanfang Hospital，Southern Medical University；College of Stomatology，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；Department of Orthodontics，Osakadental University，Japan）

AIM：To study the effects of α-tricalcium phosphate（α-TCP）/atelocollagen sponge composite in the repair of calvarialdefects in rats.METHODS：Bonedefects（diameter，8 mm；depth，1.0 mm）were created in 28 male SD rats aged 8 weeks.The rats weredivided into 3 groups.In α-TCP group（n=12）the bonedefects were filled with α-TCP/atelocollagen sponge composite，in positive control group（n=12）with autogenous bone，in blank control group（n=4）with nothing.The rats in α-TCP and positive control groups were euthanized at 4，6，and 8 weeks after surgery respectively（n=4）.The rats in blank control group（n=4）were euthanized 8 weeks after surgery.The calvarial bone was scanned by micro-CT.HE TRAP and ALP staining were performed for the evaluation of new bone formation.RESULTS：Micro-CT images at 8 weeks after surgery revealed that，in α-TCP and positive control groups the bone volume was as（69.7±3.95）%and（42.475±4.38）%respectively（P＜0.05）.Histological analysis revealed that in α-TCP group new bone contiguous with original bone was observed and the composite was absorbed.In positive control group lot of osteoclasts and absorption of the transplanted autogenous bone were observed.In blank control group little new bone was observed at the boundary of thedeffects.CONCLUSION：α-TCP/atelocollagen sponge composite is effective in the repair of bonedefect.

criticaldefect；α-tricalcium phosphate/atelocollagen sponge composite；autogenous bone

［文献标识码］A ［文章编号］1005-2593（2015）04-0223-06

10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.04.008

2014-09-30；

2015-02-05

国家自然科学基金项目（81371137）

李佩祺（1987-），男，汉族，广东深圳人。硕士生（导师：吴补领）

吴补领，E-mail：bulingwu@smu.edu.cn