左乙拉西坦对癫痫大鼠海马组织中μ—calpain及caspase—3表达的影响

韩丽萍 王海燕 乔霜等

【摘要】康模罕狙芯渴峭ü鄄霯EV对癫痫大鼠认知情况及海马组织中μ-calpain和caspase-3表达的影响，来探讨LEV的抗癫痫作用及其机制。方法：取三周龄Wistar大鼠随机分为四组：NS组、LEV组、Li-pilo组和Li-pilo+LEV组。采用氯化锂-匹罗卡品诱导建立癫痫大鼠模型，建模成功24 h后，LEV组和Li-pilo+LEV组分别给予200 mg/（kg·d） LEV。采用Morris水迷宫评价大鼠的学习与记忆的能力，免疫组织化学法检测各组大鼠海马组织中的μ-calpain及caspase-3的表达水平。结果：1.与NS组相比，LEV组的逃避潜伏期和穿越平台次数无显著差异 （P>0.05）；而与Li-pllo组相比，Li-pllo+LEV组的逃避潜伏期显著缩短，而穿越平台次数则显著增加（P<0.05），但未恢复到正常水平。2.与NS组相比，LEV组的μ-calpain和caspase-3的蛋白表达无显著变化（P>0.05）；而与Li-pllo组相比，Li-pllo+LEV组的μ-calpain和caspase-3的蛋白表达则显著减少（P<0.05），但未恢复到正常水平。结论：LEV 可以改善癫痫大鼠的学习和记忆的能力，该作用可能是通过调节海马组织中的μ-calpain及caspase-3的表达实现的。

【关键词】左乙拉西坦；癫痫；μ-calpain；caspase-3

【中图分类号】R722.12 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）03-0095-02

癫痫（epilepsy）是神经系统最常见的疾病之一，全球约有3500万患者，患病率为5%～7%，而我国也约有650万患者正在遭受该病的困扰。癫痫是一组以脑部功能失常为特征的综合征，具有突然的发作性，重复性，和短暂性为特点。可以说是儿童期最为常见的神经系统疾病之一。而癫痫持续状态（status epilepticus， SE）是癫痫的严重状态，是癫痫反复发作或持续状态，可以造成神经细胞的凋亡和坏死，并引起认知功能的损害。左乙拉西坦（Levetiracetam， LEV）作为国际上公认的一种抗癫痫药物（antiepileptic drugs， AEDs）的新品种，凭借其独特的抗癫痫机制，临床效果的高效和安全性及良好的药物动力学特点，目前已经在国内和欧美广泛应用于对癫痫的治疗。LEV具有抗癫痫和神经保护双重作用[1]。王海燕等[2]在研究中发现左乙拉西坦在治疗癫痫的同时，还会改善癫痫大鼠的认知功能。张岩等[3]在左乙拉西坦对癫痫大鼠认知功能的影响研究中也观察到，左乙拉西坦可改善癫痫大鼠的学习记忆能力。本研究主要采用免疫组织化学染色法检测LEV对癫痫大鼠海马组织中μ-钙蛋白酶（μ-calcium-activated non-lysosomal protease，μ-calpain）及半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）蛋白表达的影响，并采用Morris水迷宫法检测大鼠空间记忆和学习能力，来探讨LEV抗癫痫作用的机制及其对认知的影响。

1 材料与方法

1. 1 实验动物及模型制备

取三周龄健康Wistar大鼠（55±10g）124只（佳木斯大学动物实验中心提供），雌雄不限，随机的分为四组：正常对照组（NS）28只，左乙拉西坦对照组（LEV）28只，癫痫对照组（Li-pilo）34只，左乙拉西坦治疗组（Li-pilo+LEV）34只。

参考文献制备癫痫大鼠模型：Li-pilo组和Li-pilo+LEV组的大鼠首日腹腔注射1.27%氯化锂127 mg/Kg，24h后再给予M胆碱受体阻滞剂丁溴东莨菪碱1 mg/Kg，30min后腹腔注射1% 匹罗卡品100 mg/Kg。观察大鼠行为变化的情况。根据Racine分级标准[4]，将达到Ⅲ～Ⅴ级进入癫痫持续状态的大鼠归于致痫成功组；未达到Ⅲ～Ⅴ级的大鼠，继续注射匹罗卡品直至注射次数达到6次，若注射6次后仍未达到标准，则归于致痫不成功组，弃之不要。将造模成功大鼠继续分为Li-pilo组和Li-pilo+LEV组。NS组及LEV 对照组均在相同时间点给予等体积的生理盐水。

1. 2 方法

1.2.1 给药方案 Li-pilo+LEV组和LEV组在成模24h后给予200 mg/（kg·d） LEV灌胃，Li-pilo组和NS组给予等体积的生理盐水灌胃，每日在相同时间点给予一次灌胃。

1.2.2 留取标本及检测指标

（1）癫痫模型制备成功24h后，采用Morris水迷宫法每日测试各组大鼠的行为学指标：①定位航行实验：每天分为2个时间段，每个时间段训练大鼠4次，一共需要4天完成，观察并记录大鼠在60s内找到平台的时间（逃避潜伏期，escapelatency），反應大鼠空间学习和记忆能力；②空间搜索实验（spatial probe test）：即在第5d将平台撤掉，观察和记录大鼠90s内穿越平台的次数，用于测量大鼠对空间位置的记忆能力。

（2）LEV给药后的第7、14、28天每组随机选取8只大鼠，给予10%水合氯醛麻醉之后，断头处死，分离出大鼠的海马组织，在 -70℃给予保存，免疫组化染色法检测大鼠海马组织中μ-calpain及caspase-3的表达情况。

1.2.3 检测试剂 LEV购于美国sigma公司；μ-calpain及caspase-3抗体及免疫组化试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 统计学分析 使用SPSS 16.0软件进行统计分析，实验数据为计量资料，用 表示，组间差异比较采用方差分析，有统计学意义时进一步用LSD法做两两比较。检验水准α为0.05。

2 结果

2.1 Morris水迷宫测试

与NS组相比，LEV组的逃避潜伏期和穿越平台次数无显著差异 （P>0.05）；而与Li-pllo组相比，Li-pllo+LEV组的逃避潜伏期显著缩短，而穿越平台次数则显著增加（P<0.05），但未恢复到正常水平。（见表1）