H1N1亚型猪流感诊断方法的研究新进展

摘要 2009年，甲型H1N1流感在全球多个地方猪和人群中暴发，给人民群众的生命健康带来了巨大威胁，给经济发展和社会稳定产生了严重影响。及时快速的诊断是有效控制疫情大规模暴发的最有效途径之一。近几年随着现代分子生物学技术发展，猪流感诊断方法在快速、准确性方面有了很大提高。对H1N1猪流感概况及猪流感的诊断方法进行了综述。

关键词 甲型流感；H1N1；猪流感；诊断方法

中图分类号 S85 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）05-127-02

基金项目 广东省科技计划社会发展项目（2010B080701024）；广东省科技计划特定任务项目（2011B060700075）；广州市科技计划项目（201222426）。

作者简介 蔡春梅（1962- ），女，广东揭西人，畜牧师，从事动物疫病防控研究。*通讯作者，兽医师，从事动物疫病诊断和检测。

收稿日期 20141225

2009年3月，发生在墨西哥的人感染猪流感疫情很快在多个国家发生。起初WHO将其称为“人感染猪流感”，然后又将其更名为“甲型H1N1流感”[1]，由此引起人们对猪流感病的高度关注。它是一种新型呼吸道疾病，其病原是人流感病毒基因、禽流感病毒基因和猪流感病毒基因混合的重配株，其造成的疫情来势凶猛，危害极大，引起世界各国的广泛关注。

据报道，猪在“禽—猪—人”的种间传播链中，充当禽、人、猪流感病毒重组和复制的“混合器”，扮演着流感病毒中间宿主及多重宿主的作用，猪流感在人和动物流感的病原学、生态学及流行病学中占有举足轻重的地位。此外，流感病毒依靠抗原漂移与抗原重组机制不断发生变异[1]。及时快速的诊断是有效控制疫情大规模暴发的最有效途径之一。因此，猪流感（Swine influenza，SI）的诊断具有重要意义，但是在临床上及时检测还有一定难度，需要借助实验室的检测方法来进行诊断。猪流感的诊断方法研究经过多年发展，已取得新进展。笔者结合一些新文献报道，对H1Nl亚型猪流感的诊断方法进行了综述。

1 猪流感概述

SI是由SIV引起的传染性疾病。甲型流行性感冒病毒自1918年西班牙流感严重疫情以来，诊断与防控研究取得很好进展，已经证实SI在人和动物流感的病原学、生态学及流行病学中占据重要地位。

1.1 猪流感（SI）是世界性分布的危害猪的传染性呼吸道病

SI是一种由正粘病毒科猪流感病毒（Swine Influenza Virus，SIV）感染可引起的呼吸道传染病。SIV可引起不同日龄、性别和品种猪发病，能引起种猪繁殖障碍、育肥猪增重减慢，也是猪产生免疫抑制的主要诱因。临床以突发、咳嗽、呼吸困难、发热、衰竭、迅速康复或死亡为特征，呈世界性分布和地方性流行。

血凝素（HA）抗原和神经氨酸酶（NA）抗原，是划分流感病毒亚型的依据。猪群中除了常见的经典型H1N1、类禽型H1N1和类人型H3N2流感病毒引起的SI外，由重组病毒H1N2、H1N7、H3N6引起的SI也时有报道。目前，造成世界性流行的血清型主要有H1N1、H1N2和H3N2。其中，25%的全世界猪群曾受H1Nl型感染，比较普遍流行。在美国有30%的猪被H1N1感染过，在美国中北部猪的感染比例达51%。1998年，美国卡罗莱纳洲、明尼苏达洲、爱荷华洲和德克萨斯洲接种了H1N1SI疫苗的4个猪场暴发了严重的SI，令人对防控好猪流感产生怀疑。

豬流感在我国不少省市都有猪流感流行，主要亚型是H1N1和H3N2。2000～2003年，从我国东北、西北、华中、华东、华南及西南地区20个省、市、自治区猪群中分离到116株不同亚型SIV，其中45株为H3N2，25株为H1N1，2株为H1N2，8株为H9N2，2株为H5N1，说明在我国猪群中流行多种亚型，以H3N2、H1N1为主的流感发生流行风险大，其诊断与防控压力很大。

1.2 猪流感与甲型H1Nl流感密切相关

回顾人类流感史，20世纪人流感的3次大流行都和SI密切相关，而1976年1月美国新泽西洲佛迪狄克斯5名新兵因感染猪源H1N1病毒、1人死于肺炎的事件则是SI人畜共患病史上的里程碑。

人类感染甲型H1Nl流感病毒后的早期症状与普通人流感相似，但部分患者病情可迅速发展，来势凶猛，突然高热，体温超过39 ℃，可继发多脏器功能损伤，甚至导致死亡。最新数据表明，确诊病例的病死率为0.8%[1]。肺部体征常不明显，部分患者可闻及湿哕音或有肺部实变体征。

因此，鉴于猪流感的世界性分布，而且与甲型H1Nl流感流行密切相关，流感病毒依靠抗原漂移与抗原重组机制不断发生变异，采取科学、及时、准确的诊断方法用于临床对控制疫情大规模暴发、流行具有重要意义。

2 流感诊断方法

2.1 传统方法

传统方法是指病毒分离方法和抗体检测方法等。采集人畜的呼吸道样品进行甲型H1Nl流感的分离，也可动态检测双份血清病毒特异性抗体水平呈4倍或以上升高[2]。病毒分离方法能分离到病毒，但分离病毒的时间较长，如鸡胚接种需要2周左右时间，此外，病毒分离后还要用其他方法辅助进行鉴定，不适合大量样本的快速检测。血清抗体检测方法亦不能在感染初期抗体未产生或者抗体滴度过低时进行检测，而且可能要进行2次采血，费时费力，同样也不适用于大规模样品的快速检测[2]。

2.2 分子生物学方法

2.2.1 RTPCR方法。

该方法是我国疾控中心于2009年公布的快速检测方法，涉及4对引物：甲流M基因通用引物FluA、甲流H1N1亚型通用引物H1HA引物、人季节性流感病毒H1N1亚型通用引物HuH1HA引物、2009年甲流H1N1亚型流感病毒引物SWH1HA1引物。首先提取样品的病毒RNA，应用RTPCR的方法将样品中与引物互补的基因片段扩增后，用琼脂糖凝胶将扩增产物分离。该方法可对疑似病例的呼吸道样品进行检测，筛选甲型H1N1病毒并排除季节H1N1流感病毒[3]。

2.2.2 多重RTPCR方法。

莫秋华等[4]建立了同时检测A型流感病毒、B型流感病毒及新型甲型H1N1流感病毒的一步法多种RTPCR方法，该方法针对A型流感病毒的M基因、B型流感病毒的NS基因设计通用引物，针对新型甲型H1N1流感病毒的HA基因设计特异性引物。将3对引物加入同一个反应管中，采用一步法RTPCR的方法扩增目的片段，用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。该方法操作简单，成本低廉，特异性强，可对流感疑似病例在4～5 h内获得确诊。齐海涛等[5]也建立了同时检测H1N1和H3N2病毒的RTPCR方法。

2.2.3 实时荧光定量PCR方法。

实时荧光定量PCR方法是在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，与常规PCR相比具有灵敏度高、特异性强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等优势。

TaqMan荧光探针PCR方法的工作原理为：PCR扩增时在加入1对引物的同时，加入1个特异性的探针，该探针为1个寡核苷酸，两端分别标记1个报告荧光基团和1个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq DNA聚合酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增1条DNA链就有1个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成同步。

通过下载暴发于墨西哥的高致病性猪流感病毒H1N1型基因组序列进行同源性分析，借助计算机辅助软件结合手动设计特异性引物探针；筛选出特异性引物探针，进行灵敏度、稳定性等试验研究；优化样本RNA提取方法、优化荧光PCR反应体系，建立试剂盒的质控品；按照《体外生物诊断试剂注册管理办法》的要求进行中试，并进行应用验证，具有操作简便、易行且可快速、准确的得到检测结果的优点，可以大规模地应用各类标本的检测和筛查，有利于猪流感病毒的早期诊断和排查。它具有成本低廉、操作简便的优点，在灵敏度和特异性上将优于其他方法。

目前，国内外已有多家实验室建立了该种方法。总体而言，特异性及敏感性较好，可用于甲型H1N1病毒的检测[6-10]。

2.2.4 多重实时荧光定量PCR方法。

在单一的实时荧光定量PCR方法基础上，设计多对不同病毒的引物及探针，来实现多种病毒的集成检测。Choi等设计了同时检测甲型H1N1病毒、季节流行性病毒和H5亚型病毒的多重实时荧光定量PCR方法，检测结果可行[11]。

2.2.5 RTSmartAmp法。

为更好地达到H1N1流感的快速检测，近年来日本科研人员发明了RTSmartAmp方法，此方法包括反转录和等温扩增2个步骤，且同时在一个管中进行，无需病毒RNA的提取及PCR反应。该方法的原理是使用激子控制的敏感杂交荧光标记引物来检测甲型流感H1N1病毒的HA基因，可在40 min内出现检测结果，与季节性A（H1N1）、A型（H3N2）、B型（维多利亚）病毒无交叉反应[12]。

2.3 生物传感器法

近年来，加拿大科研人员也尝试开发一种便携式的低成本仪器—生物传感器法来检测H1N1流感病毒，研究表明生物芯片传感器能让非医务人员在1 h内检测出流感病毒，并且每次检测仅需10加元。使用目前的技术这样的检测需要花费好几百加元。通过一定的校准，研发的便携式设备还能够检测出某些病原体抗体，从而用于诊断一些传染性疾病（如SARS、HIV及乙肝等）[13]。

3 小结与讨论

猪流感的诊断方法研究经过多年发展已取得新进展，从传统的实验室诊断方法发展为基因诊断方法，具有简便、快速、高通量的优点，为流感的有效防控发挥重要作用。流感病毒依靠抗原漂移与抗原重组机制不断发生变异，常常给人类带来防控压力，给养殖业造成重创。2009年发生的甲型H1N1流感以及2013年发生的新型H7N9禽流感就是很好的案例。2009年以来，各国研究人员开展各种有效的甲型H1N1流感病毒的检测方法，也为2013年的新型H7N9禽流感的检测及防控奠定了一定的科学基础及技术支持。随着

生物技术的高速发展，基因芯片技术、生物传感器方法有望

进一步发展和成熟应用，必将更有利于猪流感的诊断与防控工作開展。

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责任编辑 陈玉敏 责任校对 李岩