水稻抗稻瘟病基因玃i1和Pi2聚合系的获得及其抗性评价

李进波 夏明元 戚华雄

摘要

[目的] 获得水稻抗稻瘟病基因Pi1和Pi2聚合系，并对其进行抗性评价。[方法]

以GD7为稻瘟病抗性基因供体，扬稻6号为受体，通过回交转育结合分子标记辅助选择，选育出10个Pi1基因和Pi2基因双基因纯合且农艺性状优良的水稻新品系，在湖北省水稻品种区域试验的稻瘟病抗性鉴定点恩施和宜昌分别对这些品系的稻瘟病抗性进行了田间鉴定。[结果]这些品系的抗性综合指数在0.8～2.0，抗级为1，表现为抗，而受体亲本扬稻6号的抗性综合指数分别为8.8和8.5，抗级为9，表现为高感，其中一个品系R587与不育系广占63S配制的杂交组合的抗性综合指数分别为2.5和3.5，抗级为3，表现为中抗，而对照扬两优6号的抗性综合指数分别为7.9和8.2，抗级为9，表现为高感。[结论]通过分子标记辅助选择聚合Pi1基因和Pi2基因能显著提高聚合系及其相应杂交组合的稻瘟病抗性。

关键词 水稻；稻瘟病；分子标记辅助选择；抗性鉴定

中图分类号 S511 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2015）05-012-03

Development and Evaluation of Disease Resistance of Pyramided Lines with Blast Resistance Genes Pi1 and Pi2 in Rice

LI Jinbo，XIA Mingyuan，QI Huaxiong （Institute of Food Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan， Hubei 430064）

Abstract [Objective] The aim was to develop and evaluate disease resistance of pyramided lines with blast resistance genes Pi1 and Pi2 in rice.[Method] Using GD7 as donors as rice blast resistance genes， and Yangdao 6 as recipient， ten new genepyramided lines with the rice blast resistance genes Pi1 and Pi2 and desirable agronomic traits were developed by bakecross breeding with molecular markerassisted selection （MAS）. The field resistance of these lines and their original parents was identified in Ensi and Yichang of Hubei. The evaluation of these lines was conducted on the resistance to blast. [Result]The results showed that the disease index of these lines were 0.8-2.0 and they were resistant. And the disease index of Yangdao 6 was 8.8 and 8.5 and it was high susceptible. The disease index of Guangzhan63S/R587 was 2.5 and 3.5 and it was moderately resistant. And the disease index of Yangliangyou 6 was 7.9 and 8.2 and it was high susceptible. [Conclusion]The conclusion was drawn that the field resistance of genepyramided lines and their hybrid was significantly increased by MAS.

Key words Rice； Blast； MAS； Evaluation of disease resistance

基金項目 湖北省农业科技创新中心资助项目（2011620002001）。

作者简介 李进波（1971- ），男，湖北天门人，副研究员，硕士，从事水稻分子育种研究。

收稿日期 20150114

由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是一种世界性的稻作病害，在世界各个水稻生产国或地区每年都有不同程度的发生[1]。在我国每年都有几个稻作区中等或偏重流行，且过去20年有增长趋势[2-3]。据全国农作物重大病虫害预警，2012年稻瘟病在我国发病面积为533万hm2，较2011年增加20%[4]。实践证明，在众多的防治措施中抗病品种的培育和种植是控制该病害最为经济、安全和有效的方法[5]。然而，由于稻瘟病病原菌生理小种的复杂性和致病性的多样性，使得现有抗病品种的抗性易被克服而很快丧失抗性。因此不断发现和利用新的抗稻瘟病基因，应用分子标记辅助选择聚合多个抗性基因，是培育具有持久抗性和综合抗性品种的有效策略。

20世纪60年代中期，日本率先开展了水稻抗稻瘟病基因的研究工作，并建立了一套抗稻瘟病基因分析用的鉴别体系。随后，国际水稻研究所和我国等产稻国也逐渐开展了水稻稻瘟病抗性遗传的系统性研究。截至2013年8月，已至少报道了68个抗稻瘟病位点共83个主效基因，23个基因已被成功克隆[6]。其中Pi1和Pi2基因是2个显性广谱抗稻瘟病基因，对我国各稻区菌株表现广谱抗性，在抗稻瘟病抗性育种中具有重要的应用价值[7-9]。

Pi1基因被定位在第11染色体长臂末端，位于2个RFLP （restriction fragment length polymorphism） 标记RZ536和NPB181之间，遗传距离分别为7.9和3.5 cM[10-11]，陈志伟等[12]将其进一步定位在SSR标记MGR4766附近，距离仅1.3 cM。Pi2基因被定位在第6染色体的短臂上，位于2个RFLP标记RG64和RZ612之间[13-14]，吴金红等[15]将其进一步定位在RG64和SSR标记AP22之间，遗传距离分别为0.9和1.2 cM。这些研究为利用分子标记辅助选择Pi1和Pi2基因培育抗稻瘟病水稻品种奠定了基础。目前，利用分子标记辅助选择技术聚合Pi1基因和Pi2基因已有许多成功的例子，如柳武革等[16]利用分子标记选择技术将Pi1基因和Pi2基因聚合到感病不育系GD7S中，获得5个Pi1和Pi2基因纯合的不育系RGD7S1、RGD7S2、RGD7S3、RGD7S4和RGD7S5，人工接种鉴定表明5个改良株系抗病频率达94.12%～97.06%，自然病圃叶瘟和穗瘟均为0级，综合评价达高抗水平。陈红旗等[17]利用分子标记选择技术将3个抗稻瘟病基因Pi1、Pi2和Pi33聚合到金23B中，导入系W1对稻瘟病的抗病频率为96.7%，明显高于携带单个基因的C104LAC（Pi1）和C101A51（Pi2）。胡杰等[18]利用分子标记选择技术将Pi1和Pi2基因聚合到改良的珍汕97B中，穗颈瘟田间自然发病结果表明，双基因聚合材料的发病率仅为0.8%，穗頸瘟抗性级别为1级，聚合Pi和Pi基因的杂交稻组合穗颈瘟发病率约6%，而不带Pi1和Pi2基因的7个杂交稻组合的发病率均较高（约90%）。

笔者利用携带抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的GD7为供体亲本，以目前应用面积最广的恢复系之一扬稻6号为受体亲本，通过回交转育和MAS相结合，旨在培育综合性状优良、抗稻瘟病的水稻恢复系和杂交组合。

1 材料与方法

1.1 材料 携带抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的供体亲本GD7引自广东农科院水稻研究所，受体亲本扬稻6号引自江苏里下河农科所。

1.2 杂交和选择程序 以扬稻6号作母本，GD7作父本杂交获得F1代杂交种，然后以扬稻6号作轮回亲本连续回交2次，再自交4次获得BC3F5株系。在回交过程中从BC1F1开始用分子标记检测抗稻瘟病基因Pi1和Pi2，选择带有目标基因且农艺性状偏向扬稻6号的单株作父本。在BC3F3中选择农艺性状优良的株系检测目标基因，选择Pi1和Pi2基因均纯合的株系。

1.3 分子标记检测中使用的分子标记 Pi1基因的检测是利用与其紧密连锁的SSR标记MRG4766[9]，Pi2基因的检测是利用与其紧密连锁的SSR标记AP22[12]，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

PCR反应体系总体积为15 μl，包括1.5 μl 10×buffer， 1.2 μl dNTPs （各2.5 mmol），引物各0.3 μl（10 μmol），1 U Taq DNA聚合酶，50 ng模板DNA。PCR反应程序：94 ℃ 4 min； 94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 35个循环； 72 ℃延伸5 min。Taq DNA聚合酶和其他相关试剂均购自大连宝生物有限公司。PCR扩增产物用0.6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，结合银染显色检测[19]。分子标记的引物信息见表1。

1.4 稻瘟病抗性鉴定 在湖北省水稻品种区域试验的稻瘟病抗性鉴定点恩施州农业科学院和宜昌市农业科学院对稻瘟病进行自然诱发鉴定，2013年对10个BC3F4代株系进行鉴定，阳性对照为供体亲本GD7，阴性对照为受体亲本扬稻6号，2014年对杂交组合广占63S/R587进行鉴定，阴性对照为扬两优6号（广占63S/扬稻6号）。每份材料种植20穴，2次重复，周围种植高感品种C039诱发发病。稻瘟病抗性评价标准参照杨仕华等[20]的方法。

2 结果与分析

2.1 分子标记辅助选择及Pi1和Pi2基因纯合系的获得 利用与Pi1和Pi2基因紧密连锁的SSR标记MRG4766和AP22对抗性基因供体亲本GD7和受体亲本扬稻6号进行多态性分析。MRG4766在供体亲本中扩增产物片段较大，在扬稻6号中扩增产物片段较小（图1）；AP22在供体亲本中扩增产物片段较小，在扬稻6号中扩增产物片段较大（图2），MRG4766和AP22在供体亲本GD7和受体亲本扬稻6号之间都具有多态性。

回交转育结合分子标记辅助选择按以下程序进行：供体亲本GD7与轮回亲本扬稻6号杂交，在F1中去除假杂种后与扬稻6号回交。在BC1F1群体中，经分子标记检测选择带有Pi1和Pi2基因的单株（图1、2）与扬稻6号回交得到BC2F1。在BC1F2群体中，经分子标记检测获得带有Pi1和Pi2基因的单株，选择农艺性状偏向扬稻6号的单株作父本，取混合花粉继续与扬稻6号回交得到BC3F1。在BC3F1群体中，经分子标记检测获得带有Pi1和Pi2基因的单株，分单株收种后种植成BC3F2株系，成熟后选择农艺性状优良的单株。种植BC3F3株系后苗期取混样检测Pi1和Pi2基因，获得Pi1和Pi2基因均纯合的株系。再根据农艺性状表现，从基本整齐的株系中选择到10个农艺性状优良的Pi1和Pi2基因聚合系。

2.2 Pi1和Pi2基因聚合系和杂交组合的抗性鉴定 2013年分别在湖北省恩施州农业科学院和湖北省宜昌农业科学院稻瘟病抗性鉴定点对这10个基因聚合系进行稻瘟病抗性鉴定。鉴定结果表明10个株系的抗性综合指数在0.8～2.0，表现为抗，其抗性与供体亲本GD7的抗性在同一个水平，而受体亲本扬稻6号的抗性综合指数分别为8.8和8.5，抗级为9，表现为高感（表2、3）。说明通过分子标记辅助选择技术导入Pi1和Pi2基因能显著提高受体亲本的稻瘟病抗性。

根据BC3F4株系田间农艺性状表现，综合性状优良的株系13C587入选，暂定名为R587。2014年春季在海南利用不育系广占63S与R587配制杂交组合，同年正季分别在恩施和宜昌进行抗性鉴定，鉴定结果表明广占63S/R587的抗性综合指数分别为2.5和3.5，抗级为3，表现为中抗，而对照品种扬两优6号的抗性综合指数为7.9和8.2，抗级为9，表现为高感。说明Pi1和Pi2基因聚合系与不育系配制的杂交组合的稻瘟病抗性也明显增强。

3 结论与讨论

目前生产上应用的骨干不育系和恢复系及其配制的组合稻瘟病抗性不强，限制了其推广应用。笔者对参加2013年湖北省中稻区试和2014年湖北省中稻区试的组合进行了统计，在2013年湖北省中稻区试中可以确定以广占63S为母本配制的杂交组合13个（包括对照品种扬两优6号），区试稻瘟病抗性鉴定结果2个组合的抗级为3级，2个组合的抗级为5级，1个组合的抗级为7级，其余8个组合的抗级为9级，少数组合的稻瘟病抗性较好，很可能是其恢复系的稻瘟病抗性得到了改良。在2014年湖北省中稻区试中可以确定以广占63S为母本配制的杂交组合18个，区试稻瘟病抗性鉴定结果除1个组合抗级为3级外，其余17个组合（包括对照品种扬两优6号）的抗级都为9级，其中有13个组合的抗性综合指数在7.0以上，未达到湖北省水稻品种审定委员会规定的稻瘟病抗性综合指数≤7.0的标准，也就意味着在湖北省中稻区试中，以广占63S为母本配制的杂交组合大多数会因其稻瘟病抗性差而不能通过品种审定。在该研究中以广占63S为母本与Pi1和Pi2基因聚合系R587配制的杂交组合，在湖北省水稻品种区试稻瘟病抗性鉴定点抗级能达到3级，抗性综合指数在3.5以下，与对照品种扬两优6号相比其稻瘟病抗性得到了明显的改良。目前正在安排广占63S/ R587的试制种和品种比较试验，如果广占63S/ R587能保持揚两优6号的产量优势和品质性状，在湖北省水稻生产中将具有广阔的应用前景。

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责任编辑 乔利利 责任校对 李岩