养阴益气合剂对博来霉素所致肺纤维化大鼠的影响

赵晨宇等

摘要：目的 观察养阴益气合剂对博来霉素所致肺纤维化大鼠的影响，探讨其可能的作用机制。方法 将SPF级SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组和养阴益气合剂低、中、高剂量组。采用气管内滴注博来霉素方法复制肺纤维化大鼠模型，造模后1 d，各给药组给予相应药物灌胃。分别于第7、14、28日取肺组织，Masson染色观察病理变化，碱水解法检测羟脯氨酸（HYP）含量，Western blot检测基质金属蛋白酶-9 （MMP-9）和基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）蛋白表达。结果 造模7 d，病理切片显示模型组大鼠肺部胶原较正常组明显增多，即造模成功；HYP含量同步显著升高（P<0.01）；造模28 d，病理切片显示模型组肺泡间隙胶原大量沉积，部分肺泡结构丧失，HYP含量仍处于高值（P<0.01）。经养阴益气合剂中、高剂量28 d干预治疗，肺组织胶原沉积均有所改善，且表现出剂量相关性，HYP含量明显减少（P<0.01），养阴益气合剂高剂量组表现出与阳性药组相当的效果。Western blot检测结果显示，造模7 d在正常肺组织低表达的MMP-9和TIMP-1蛋白水平显著升高（P<0.05），至28 d持续处于高表达状态（P<0.05）。与模型组比较，第14日养阴益气合剂高剂量组MMP-9水平明显降低（P<0.05），第7、14、28日TIMP-1表达水平明显降低（P<0.05）。结论 养阴益气合剂能有效抗肺纤维化，推断其通过抑制TIMP-1和MMP-9的表达，调控促进胶原的水解，抑制胶原蛋白的沉积，最终抑制肺纤维化。

关键词：养阴益气合剂；肺纤维化；羟脯氨酸；基质金属蛋白酶；基质金屬蛋白酶抑制剂；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.018

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）09-0063-05

Effects of Yangyin Yiqi Mixture on Bleomycin-induced Pulmonary Fibrosis in Rats ZHAO Chen-yu1，2， ZHU Yong3， ZHOU Ji-pu3， CHEN Dong4， YIN Wen1， LI Zhi-yong1， WANG Hong5 （1.Institute of Chinese Minority Traditional Medicine， Minzu University of China， Beijing 100081， China；2.Dandong School of Traditional Chinses Medicine， Dandong 118000， China；3.Beijing TCM Hospital Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100010， China；4.Xinglong TCM Hospital， Xinglong 067300， China；5.Shunyi TCM Hospital Affiliated to Beijing TCM Hospital， Beijing 101300， China）

Abstract：Objective To investigate the effects of Yangyin Yiqi Mixture on pulmonary fibrosis caused by bleomycin in rats；To discuss its possible mechanism. Methods SD rats were randomly divided into normal control group， model group， dexamethasone acetate group， low-dose， middle-dose and high-dose Yangyin Yiqi Mixture groups. Bleomycin was used to establish pulmonary fibrosis rat models through endotracheal instillation. One day after molding， each medication group received gavage with relevant medicine. Lung tissues were taken on the 7th， 14th and 28th day. Masson staining was used to observe pathological change；alkalinehydrolysis was used to detect HYP content；Western blot was used to detect the protein expressions of MMP-2 and TIMP-1. Results Compared with the normal control group， on 7th day， collagen in lung tissue of rats in model group markedly increased；the content of HYP in lung tissue significantly increased （P<0.01）. On 28th day， collagen was deposited diffusely and the alveolar was destroyed；content

基金项目：北京市中医药管理局科技项目（JJ2010-01）

通讯作者：王洪，E-mail：wanghong30888@163.com

of HYP in lung tissue increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， deposited collagen in lung tissue was alleviated， and the content of HYP were remarkable reduced in middle and high dose Yangyin Yiqi Mixture groups and displayed dose-dependent. Western blot results showed that the protein expressions of MMP-2 and TIMP-1 increased quickly compared with the low expression of normal lung tissue in the 7th day of molding （P<0.05）， and reached high expression in the 28th day. Compared with the model group， the level of MMP-9 in high-dose Yangyin Yiqi Mixture group decreased significantly in the 14th day；the expression of TIMP-1 decreased significantly in the 7th， 14th and 28th day （P<0.05）. Conclusion Yangyin Yiqi Mixture can effectively resist pulmonary fibrosis， which may be realized by inhibiting the expressions of TIMP-1 and MMP-9， regulating and promoting collagenic hydrolysis and restraining deposition of collagen.

Key words：Yangyin Yiqi Mixture；pulmonary fibrosis；hydroxyproline；matrix metalloproteinases；inhibitors of matrix metalloproteinases；rats

养阴益气合剂为首都医科大学附属北京中医医院名老中医温振英主任医师处方，主要由黄芪、党参、北沙参、黄精、玄参等中药组成。该方可有效改善肺功能，对特发性肺纤维化、气阴两虚证有一定疗效[1]，对早期糖尿病肾病、口腔扁平苔蘚、儿童哮喘、SARS患者恢复均有较好的疗效[2-6]。因此，我们推测抗炎是养阴益气合剂的主要治疗作用之一。肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）早期炎性反应，其实质是肺泡损伤，导致后期细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中的胶原在肺泡和肺间质内沉积，最终发生PF。统计资料显示，PF 5年生存率低于50%，10年生存率约30%[7]。目前医学界最有效的治疗方法是肺移植，尚缺乏特效的治疗药物[8-9]。本实验以博来霉素（bleomycin，BLM）所诱导的PF大鼠为模型，依据病理检测评价养阴益气合剂对大鼠PF形成的干预作用，Western blot检测肺组织中基质金属蛋白酶-9 （MMP-9）和基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）表达变化，探讨其可能的作用机制，为养阴益气合剂临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性SPF级SD大鼠180只，体质量（200±20）g，6周龄，北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCKK（京）2012-0001。12 h交替昼夜循环，恒温（22 ℃）、恒湿（50%）环境常规饲养。

1.2 药物

养阴益气合剂，首都医科大学附属北京中医医院，批号20130130；醋酸地塞米松片，天津力生制药股份有限公司，批号1209028；注射用盐酸博来霉素，日本化药株式会社，批号420202。

1.3 主要试剂与仪器

Masson三色染色液，罗基北京生物技术有限公司，批号130717；羟脯氨酸（HYP）试剂盒（碱水解法），南京建成生物工程研究所，批号20130412；MMP-9山羊多克隆抗体、TIMP-1兔多克隆抗体，美国Santa公司；β-actin小鼠单克隆抗体、山羊抗兔HRP标记、兔抗山羊HRP标记，北京中杉金桥生物技术有限公司。TE16721倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）， FlexStation 3微孔板检测系统（美国Molecular Devices公司），垂直电泳系统（北京百晶生物技术有限公司），Powerpachv Power、170-3940半干湿转膜仪、金属加热器（美国Bio-Rad公司）。

1.4 分组及造模

SD大鼠适应性饲养7 d后，按体质量随机分为正常组、模型组、阳性药组和养阴益气合剂低、中、高剂量组（中药低、中、高剂量组）。参照文献[10]方法，10%水合氯醛溶液0.3 g/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定于解剖板上，剪去颈部被毛，常规消毒，剪约1 cm的切口，逐层暴露气管，静脉输液针经气管软骨间隙向心端刺入，尽可能接近气管分叉处，快速注入BLM生理盐水溶液后立即注入0.3 mL空气，注射后立即拔出针头，竖起解剖板，使动物直立并左右缓慢旋转2 min，使药液在两肺中尽可能分布均匀，缝合皮肤，局部消毒。正常组注入等体积生理盐水。

1.5 给药

造模次日，正常组和模型组予蒸馏水1 mL/0.1 kg灌胃；阳性药组予醋酸地塞米松，前3 d给药1 mg/kg，后3 d给药0.8 mg/kg，之后每2 d逐渐减少，剂量为0.6、0.4、0.2、0.1 mg/kg，第14日停止给药；中药低、中、高剂量组大鼠给药剂量按原药材计算分别为11、22、44 g/kg（相当于成人用药剂量1.76、3.52、7.04 g/kg），给药体积为1 mL/0.1 kg。

1.6 Masson染色方法

分别于给药后第7、14、28日，各组取1/3大鼠用于实验检测。大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后仰卧位固定于解剖板上，打开胸腔，结扎右肺主支气管，取完整右肺，于-80 ℃冰箱冻存；将平口针头由心尖进入右心室，止血钳固定后，剪开左心耳，快速灌注PBS 100～200 mL，再缓慢灌注4%甲醛溶液，至左心耳流出无色液体，取出完整左肺，于4%甲醛溶液中固定。常规石蜡包埋，切片，进行Masson染色。

1.7 肺組织中羟脯氨酸含量测定

取肺组织100 mg左右，采用碱水解法测定肺组织匀浆中HYP含量，测定方法按照试剂盒说明书步骤进行。

1.8 Western blot检测基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶抑制剂-1的表达

取肺组织样品100 mg，液氮速冻后在玻璃研钵中充分研磨，加蛋白裂解液500 μL，4 ℃、12 000 r/min离心30 min，收集上清液，即总蛋白样本。按BCA蛋白定量试剂盒操作方法进行蛋白定量，跟据上样量进行分装，每次上样体积约为20 μL，置于-20 ℃保存。上样前加入buffer，100 ℃加热5～10 min。将处理好的样品加入浓缩胶的梳孔中，开始电泳，初始电压为80 V，待样品完全进入分离胶后增至120 V，溴酚蓝到达分离胶底部时电泳完毕。依照Marker估计目的条带的位置切取胶，依次安放转印夹层（滤纸-凝胶-膜-滤纸），将转印夹层平行放至半干湿转膜仪内，接通电源，根据膜的面积大小以1 cm2/0.8 mA比例恒流转移0.5～1 h。取转膜后的PVDF膜，用5%脱脂奶粉，室温上下摇摆2 h（或4 ℃过夜）封闭；用新鲜配制的5%脱脂奶粉封闭液稀释一抗（1∶500），将PVDF膜浸入一抗孵育，室温上下摇摆2 h（或4 ℃反应过夜），孵育完毕，用1×TBST洗膜3次，每次15 min；根据一抗，选用合适的二抗，用新鲜配制的5%脱脂奶粉封闭液配制二抗反应液（1∶1500），将PVDF膜浸二抗反应液，室温上下振荡1 h，孵育完毕，用1×TBST洗膜3次，每次5 min，准备显影。将载有蛋白的PVDF膜放入暗盒中，滴加发光液（A和B发光液等量均匀混合）于膜上，滤纸吸去多余发光液；于暗室中取胶片覆盖于膜上，关闭暗盒，进行曝光；曝光完成后立即把胶片放入显影液中，往复振荡，待出现条带后终止显影，水冲去残留显影液，再放入定影液中定影，以胶片透明为止，水冲去残留定影液，室温晾干。

1.9 统计学方法

采用SAS8.1统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 养阴益气合剂对肺纤维化大鼠肺胶原沉积的影响

正常组大鼠肺部结构正常，肺泡间有少量胶原；模型组大鼠，造模7 d时肺部胶原已明显增多，28 d时胶原大量增生，肺泡结构被破坏，并逐渐向肺间质延伸、聚集；阳性药组大鼠肺部胶原聚集状况明显轻于模型组，但肺泡存在塌陷萎缩；中药高、中剂量组较模型组PF程度明显减轻，中药高剂量组尤为明显，胶原沉积状况有显著改善，肺泡结构基本趋于舒展完整；养阴益气合剂低剂量与模型组相比，大鼠肺部胶原沉积的状况略有缓解。结果见图1、图2。

2.2 养阴益气合剂对肺纤维化大鼠肺组织中羟脯氨酸含量的影响

造模7 d，模型组大鼠肺组织中HYP含量较正常组明显增多（P<0.01）；造模28 d，模型组肺组织中HYP仍处于高水平状态（P<0.01），中药中、高剂量组HYP含量降低P<0.01）。结果见表1。

2.3 养阴益气合剂对肺纤维化大鼠肺组织基质金属蛋白酶-9蛋白表达的影响

MMP-9在正常肺组织处于低表达状态。模型大鼠肺组织MMP-9表达水平升高，造模7、28 d与正常组比较差异显著（P<0.05）。14 d中药高剂量组MMP-9升高水平明显低于模型组（P<0.05）；造模28 d表达水平仍处于较稳定的状态。阳性药组在损伤起始阶段MMP-9表达升高，在干预过程中始终接近模型组水平（P>0.05）。结果见图3。

2.4 养阴益气合剂对肺纤维化大鼠肺组织基质金属蛋白酶抑制剂-1蛋白表达的影响

TIMP-1在正常肺组织中低表达。造模7 d TIMP-1显著升高（P<0.05），14、28 d持续处于高表达状态（P<0.05）。中药高剂量组TIMP-1表达水平接近正常组，显著低于各时点模型组（P<0.05）。阳性药组TIMP-1表达水平与模型组相当，仅在造模28 d出现下降，但与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图4。

3 讨论

PF的发生与多种因素相互作用或刺激有关，如家族性遗传、氧化应激与炎性反应、持久性急性呼吸窘迫综合征、长期吸入二氧化硅及BLM的毒副作用等均可诱发PF。BLM是临床广泛应用的化学治疗辅助药，具有显著的细胞毒和抗癌特性。在临床使用过程中发现，接受BLM治疗的患者具有较高的PF发病率。深入研究发现BLM能导致肺泡上皮DNA损伤，并促进趋化因子释放和活化白细胞而诱发PF[11]，使用BLM制备PF模型是目前国际上研究PF的最常用方法，由其诱导的PF已被证实与遗传背景和氧化应激状态等有关[12]。PF患者肺组织中MMPs和TIMPs处于不平衡状态，细胞因子和转化生长因子诱导的Notch信号均上调，胶原蛋白在肺实质过度沉积[13]。本实验采用于气管下部注入1.5 mg/kg BLM诱发PF大鼠模型[10，14]，结果显示BLM能诱导大鼠PF形成，肺组织经Masson染色呈蓝色，肺间质内均出现大量胶原纤维沉积。

为量化评价PF模型和药效，对大鼠肺组织中HYP进行定量检测。HYP是胶原蛋白特征性成分，而胶原蛋白是构成组织中胶原纤维的主要成分。PF过程即是胶原不断沉积过程，因此，肺组织中HYP含量被广泛用于对PF的研究，可以有效说明胶原纤维增多。本实验中，造模后各个时间点大鼠肺组织中HYP含量均高于正常组，7、28 d模型组更加显著（P<0.01），说明给予BLM之后肺组织中胶原纤维含量明显增加；中药低、中、高剂量均能减少同期大鼠肺组织中HYP含量，说明养阴益气合剂能够抑制PF过程中胶原的产生，或加速其降解，而达到对PF的治疗作用。