复合乳酸菌在苹果酒中的生长和苹果酸—乳酸发酵特性的研究

李凤 黄业传 吴照民

摘要[目的]探索川秀乳酸菌1L型（混合型）在苹果酒中的苹果酸-乳酸发酵特性。[方法]以川秀乳酸菌1L型（嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌）作为苹果酒二次发酵的发酵菌种，通过单因素试验分析了接种量、SO2浓度、酒精度、pH和发酵温度对乳酸菌生长和总滴定酸的影响。[结果]试验表明，当接种量达到5×106 CFU/ml时接种量对乳酸菌的生长影响不明显。当SO2浓度达到50 mg/L或者酒精度达到8.0%（V/V）时，或者pH降至3.2或者温度低至20 ℃时，乳酸菌生长受到明显抑制，降酸不完全。活菌数与总滴定酸的降低速率呈正相关。[结论]研究可为苹果酒的苹果酸-乳酸发酵工艺条件的研究提供参考，但各因素间的协同和互作的结果尚待研究。

关键词复合乳酸菌；苹果酒；苹果酸乳酸发酵

中图分类号S609.9；TS20文献标识码

A文章编号0517-6611（2015）31-188-03

The Study of Growth and Malolactic Fermentation Characteristics of Lactobacillus Complex in Cider

LI Feng1，2， HUANG Yechuan1，2， WU Zhaomin1，2

（1.College of Life Science and Technology， SouthWest University of Science and Technology， Mianyang， Sichuan 621010； 2.Institute of Food Science and Technology Research， SouthWest University of Science and Technology， Mianyang， Sichuan 621010）

Abstract [Objective]The growth and malolactic fermentation characteristics of lactobacillus complex in cider were explored. [Method] Through single factor test， the influence of inoculation amount， SO2 concentration， pH value， fermentation temperature and alcoholic strength on the growth of lactobacillus and deacidification was studied. [Result] The results indicated that the effect was unobvious when the inoculation amount was above 5×106 CFU/ml and the growth and deacidification were inhibited when SO2 concentration reached 50 mg/L or the alcoholic strength reached 8.0%（V/V） or the pH value was lower than 3.2 or the temperature was lower than 20 ℃. Deacidification was positively related to viable count. [Conclusion] The results can provide reference to further research but the interaction effect of the factors need further research.

Key words Lactobacillus complex； Cider； Malolactic fermentation

苹果酸-乳酸发酵（Malolactic Fermentation，MLF）是L苹果酸在乳酸菌的苹果酸乳酸酶的作用下转化为L乳酸并放出二氧化碳的过程[1]。MLF在包括苹果酒和葡萄酒在内的果酒的酿造中有非常重要的作用。首先，MLF是目前最主要的果酒生物降酸方法，虽然物理或者化学的方法也能降低果酒的酸度，但只能作用于酒石酸而对苹果酸没有什么效果[2]；其次，MLF降低了酸度，削弱了收敛酸的作用，减小酒的粗糙和酸涩感，使酒的风味呈现多样性口感饱和、圆润；并且经MLF发酵，酒体中的营养成分被消耗同时部分细菌素等抑菌物质产生，提高了果酒抗杂菌的能力，增强了酒的稳定性。目前关于MLF的研究资料非常丰富，主要可以归纳为3个方面：发酵菌株的筛选，主要考虑菌株的生长能力、发酵能力、耐受酒精及二氧化硫的能力和絮凝能力，能启动MLF的乳酸菌主要有明串珠菌属、乳杆菌屬、酒类酒球菌属和片球菌属；MLF对果酒感官品质的影响研究，主要包括对风味和色泽的影响研究；MLF主要影响因素的研究以及在葡萄酒和果酒酿造中进行苹果酸-乳酸发酵的工艺参数的优化和控制。乳酸菌在MLF进行的过程中除进行苹果酸分解外还分解酒醪中的柠檬酸、残糖等产生一些代谢副产物对成品酒的感官品质产生影响，不同的研究都发现不同的发酵菌种不论是在发酵能力、生长能力或者对成品酒的风味影响方面都有较大的差异，目前关于单一菌株在MLF中的相关研究报道较多[2-5]，关于复合菌株在MLF的相关研究报道较少[6]。笔者拟以川秀乳酸菌1L型（嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌）作为苹果酒二次发酵的发酵菌种，研究其生长性及其苹果酸-乳酸发酵特性。

1材料与方法

1.1材料

川秀乳酸菌1L型，北京川秀科技有限公司；葡萄酒活性干酵母，湖北宜昌安琪酵母股份有限公司；苹果，市售红富士。主要试剂：蔗糖、酒精均为食品级；亚硫酸等均为分析纯，成都市欣海兴化工试剂厂。主要仪器：精密pH计，上海虹益仪表有限公司；超纯水仪（MiLLiQbiocel），美国密理博公司。适应性培养基为MRS培养基∶无菌苹果前酵酒（1∶1）。

1.2方法

1.2.1苹果汁的制备及前发酵。

选择经贮存后熟超过1个月，果实中淀粉充分转化成糖的苹果，洗净去核后切块，尽量减少苹果与空气接触，同时加入维生素C护色。按照苹果∶水1∶1的比例加水打浆。在苹果浆中加入果胶酶和纤维素酶，50 ℃恒温水浴保持2 h后用2层医用纱布过滤制得苹果汁。测定苹果汁的糖度、酸度，并用苹果酸将苹果汁滴定酸调整至5 g/L用于前发酵，按照初始糖度调整至180 g/L计算蔗糖添加量，并在发酵过程中分批加入。活性干酵母用2%蔗糖溶液按照1∶10比例在35～38 ℃条件下复水活化15～20 min，复水完成后温度降至30 ℃左右时接入至苹果汁中进行发酵。发酵完成后过滤得苹果前酵酒。用亚硫酸调整其总二氧化硫（SO2）浓度分别为30、40、50和60 mg/L，以食用酒精调整其酒度分别为6.0%、7.0%、8.0%和9.0%（V/V），用1 mol/L HCl 或者4 mol/L NaOH溶液调整pH分别为3.2、3.4、3.6和3.8备用。

1.2.2川秀乳酸菌在苹果酒中的生长及苹果酸乳酸发酵特性。

将川秀乳酸菌在MRS 培养基中培养至对数末期，以 5%（V/V）接种量分别接种于适应性培养基中，30 ℃条件下静置培养 24 h后离心并用无菌水调整细胞浓度为1.0×108CFU/ml，以 5%、7%、10%和12%（V/V）的接种量分别接种于“1.2.1”项下苹果酒中，分别在16、20、24和30 ℃下进行苹果酸-乳酸发酵。每隔24 h取样检测活菌数和总酸度。

1.2.3测定方法。

总活菌数的测定按照GB/T4789.35平板菌落计数法，总滴定酸的测定按照GB/T15038-2006中指示剂法（以苹果酸计）。

2结果与分析

2.1接种量对乳酸菌在苹果酒中生长和MLF的影响

在酒精度6.0%（V/V）、pH为3.6、总SO2浓度为30 mg/L的苹果前酵酒中，分别以5%、7%、10%和12%（V/V）的接种量接种乳酸菌活菌液（1.0×108CFU/ml），在25 ℃下静置密闭发酵，期间活菌数和总滴定酸的变化见图1和图2。结果表明，当接种量达到5%时菌种能保持平缓的方式生长，接种量的变化对乳酸菌的生长影响不明显。在发酵的过程中乳酸菌的总量呈现下降的趋势，与其文献报道的一致[1，4]。接种量增加降酸的速度加快，但发酵至第6天，10%和12%接种量2组的总酸接近。有研究表明，接种量增加可能导致发酵酒中的乙酸含量增加影响酒的风味[1]。因此实际生产中接种量需要谨慎选择。

2.2SO2浓度对乳酸菌在苹果酒中生长和MLF的影响

在酒精度6.0%（V/V）、pH为3.6的苹果前酵酒中，接种量为10%时不同总SO2浓度时在25 ℃下静置密闭发酵，期间活菌数和总滴定酸的变化见图3和图4。总SO2浓度为30 mg/L时乳酸菌的生长平缓能完成降酸，但是当浓度达到50 mg/L时接种后乳酸菌活菌数直线下降，降酸不完全。不同研究者的結果有较大的差异与不同菌种耐受SO2能力的差异有关[1，5]。

2.3酒精度对乳酸菌在苹果酒中生长和MLF的影响

在pH为3.6、总二氧化硫浓度为30 mg/L的苹果前酵酒中，接种量为10%时不同酒精度时在25 ℃下静置密闭发酵，期间活菌数和总滴定酸的变化见图5和图6。酒度为6.0%和70%（V/V）时乳酸菌生长平缓，能完成降酸，但是当酒度达到80 %（V/V）时接种后乳酸菌活菌数直线下降，降酸不完全。不同研究者的结果有较大的差异与不同菌种耐受酒精能力的差异有关[1，5]，另外可能与发酵的温度有关，有研究表明，随着发酵温度的升高，菌株耐受酒精的能力降低[3]。

2.4pH对乳酸菌在苹果酒中生长和MLF的影响

在酒精度6.0%（V/V）、总二氧化硫浓度为30 mg/L的苹果前酵酒中，接种量为10%时，不同pH条件下在25 ℃下静置密闭发酵，期间活菌数和总滴定酸的变化见图7和图8。活菌数随pH的降低而迅速降低，当pH降至3.2时活菌数迅速降低，降酸无法完成。当pH升高至3.6时，活菌数下降趋于平缓，降酸能顺利完成，与其他研究者的研究结果一致[1，3，5]

2.5发酵温度对乳酸菌在苹果酒中生长和MLF的影响

在酒精度6.0%（V/V）、总二氧化硫浓度为30 mg/L、pH为3.6的苹果前酵酒中，接种量为10%时，不同温度下静置密闭发酵，期间活菌数和总滴定酸的变化见图9、10。结果表明，低温对乳酸菌的生长有明显的抑制作用，低温发酵时降酸的速率降低时间延长，当温度低至20 ℃时乳酸菌生长受明显抑制，降酸不完全。

3结论与讨论

SO2浓度、pH、酒精度和发酵温度对苹果酒的苹果酸-

乳酸发酵有较大的影响，当接种量达到5×106 CFU/ml时菌种能保持平缓的方式生长，接种量的变化对乳酸菌的生长影响不明显。因此通过增大接种量以缓解SO2浓度、pH、酒精度和发酵温度等因素对乳酸菌生长抑制的效果是有限的，筛选对抑制因素有更好耐受性的菌株就十分必要。活菌数与总滴定酸降低速率间呈正相关性，表明川秀乳酸菌1L型在MLF中可能是通过苹果酸活菌代谢即苹果酸在转运蛋白作用下运输到胞内，经脱羧产生乳酸和CO2，将乳酸排出胞外，但是这还需要对培养液中苹果酸乳酸酶的活性测定进行验证。该试验仅是发酵过程中的乳酸菌生长和总滴定酸度的改变，而苹果酒后发酵中还需要考虑酒的感官和其他理化指标。因此该研究可为苹果酒的苹果酸-乳酸发酵提供一定的参考。

安徽农业科学2015年

参考文献

[1] 潘海燕.苹果酒苹果酸乳酸发酵的研究[D].无锡：江南大学，2004.

[2] 张春晖.中国优良酒类酒球菌（Oenococcus oeni）的分离筛选及苹果酸-乳酸发酵研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2001.

[3] 李爱霞.植物乳杆菌苹果酸-乳酸发酵性能及其苹果酸-乳酸酶的研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2014.

[4] 熊犍，何翠婵，林伟锋，等.植物乳杆菌在青梅汁中的生长及苹果酸乳酸发酵特性研究[J].现代食品科技，2013（12）：2850-2854，2914.

[5] 李维新.优良MLF乳酸菌选育及其产酶特性研究与应用[D].福州：福建农林大学，2012

[6] LERM E.The selection and characterization of lactic acid bacteria to be used as a mixed starter culture for malolactic fermentation[M].Stellenbosch：Stellenbosch University，2010.