微生物与发酵工艺对苹果酒品质影响的研究概述

张志勇，刘震，周峻岗，吕红*

1(复旦大学 生命科学学院，遗传工程国家重点实验室，上海，200438) 2(复旦大学 上海工业菌株工程技术研究中心，上海，200438)

根据联合国粮农组织的统计数据(www.fao.org/faostat/en/#data/QC/)，近10年以来世界苹果总产量逐年增加。中国是世界第一大苹果生产国，苹果的年产量稳步提高，平均年增长92万t。2019年中国苹果产量为4 243万t(图1-a)，占当年世界总产量的49%。苹果富含多酚和膳食纤维[1]，对人体具有多种健康促进作用。研究表明苹果中含有的生物活性成分(类黄酮、多酚等)对多种类型的癌细胞生长具有抑制作用[2]，同时在预防慢性心血管疾病、糖尿病、肥胖症[3]，改善肠道菌群[4]等方面均有明显效果。目前，我国水果原料进行深加工的比例低于30%，苹果主要以鲜食、苹果浓缩汁和果汁饮料产品为主[5]，产品附加值较低，品类较为单一，且副产物(果渣)浪费较大，亟需进行产业升级[6]。

发酵是一种历史悠久且简单经济的水果加工方法；在发酵过程中，微生物作为细胞工厂将水果原料成分，如可发酵的碳水化合物等物质，转化成多酚类化合物、有机酸、酒精和CO2等代谢产物[7]。发酵还能延长食品保质期，抑制食源性病原体，改善食品的感官特性，提高蛋白质和碳水化合物的消化率以及维生素和矿物质的生物利用度。苹果酒(cider)是一种由苹果汁(部分或全部)发酵制成的酒精饮料，酒精含量较低，在1.2%～8.5%(ol)[8]。苹果酒是仅次于葡萄酒的世界第二大发酵果酒[9]。世界上有多达25个国家在苹果产区生产苹果酒，产量最高的地区是欧洲。欧洲苹果酒和果酒协会统计数据(https://aic.org/en)显示，2019年世界苹果酒销量26.2 mhL(亿公升)，西欧地区销量14.0 mhL，占比高达52.8%；而亚洲销量仅占1.4%。中国作为世界上人口最多、近10年人均可支配收入上升最快的国家，生活富裕带来人们对更加健康的发酵产品的追求，苹果酒在中国将有潜在的庞大市场前景。

苹果酒的研究逐渐成为果酒领域的研究热点，期刊的年发表文章数量呈现快速增长趋势(图1-b，关键词apple cider，数据来源www.sciencedirect.com)，年平均增长率为12%。目前，苹果酒的研究集中于苹果原料、发酵菌种和生产工艺的探索。苹果酒和葡萄酒在微生物组成和发酵工艺方面有很多相似之处，但果实本身成分和加工特性不同，使得两者在口感方面存在较大差异。因此，对苹果酒的研究将有助于更好地了解和控制苹果酒的发酵过程，提升苹果酒品质。

影响苹果酒品质的因素有很多，苹果品种、发酵菌种、生产工艺等均会影响苹果酒的成分组成，进而引起感官品质的差异。COUSIN等[8]综述了苹果酒中微生物的组成、作用和动态变化。然而对于苹果酒的风味成分组成，以及不同因素对苹果酒感官品质的影响暂未有相关的综述。因此本文从苹果酒的分类、成分组成，以及对苹果酒品质的影响因素进行综述。

a-中国和世界苹果年产量;b-苹果酒的年发表文章数量图1 苹果的年产量和苹果酒研究的年发表文章数量Fig.1 The annual yield of apple and the number of published articles on apple cider research

1 苹果酒的分类

按酿制工艺可分为发酵型苹果酒和蒸馏型苹果酒；按CO2含量可以分为平静苹果酒和含气苹果酒；按产品特性可分为含气苹果酒、冰苹果酒、脱醇苹果酒和利口苹果酒[10]；按酒精度可分为淡苹果酒和烈性苹果酒(加拿大魁北克《苹果酒和其他苹果酒精饮料法》)。苹果酒(发酵型)是以苹果、苹果汁(浆)等为主要原料，经全部或部分酒精发酵酿制而成的发酵酒；苹果蒸馏酒是以苹果为原料，经发酵、蒸馏、陈酿、调配而成的饮料酒。苹果酒的配制酒是以发酵或蒸馏苹果酒为酒基，加入可食用的辅料或食品添加剂，进行调配、混合或加工制成的饮料酒。目前中国市场以苹果酒的配制酒为主，在发酵苹果酒的基础上，复配不同果汁、白砂糖(糖浆)、香精等，形成多口味的产品。英国、西班牙、法国、德国和爱尔兰是欧洲苹果酒的主要市场。加拿大魁北克地区是世界冰苹果酒的主要产区。表1列举了欧洲主要苹果酒的品类和特点。欧洲苹果酒酿造所用的苹果原料以苦甜型苹果为主，苹果汁发酵度较高(干型为主)，CO2含量较高，酒精度较低(4%ol左右)。

表1 欧洲主要苹果酒的种类和酿造特点Table 1 The arieties and brewing characteristics of apple ciders in Europe

2 苹果酒的成分

苹果酒的主要成分为水、糖(果糖为主)、有机酸、酚类物质和香气化合物[11]。

2.1 挥发性香气成分

果酒的香气构成主要包括：一级香气，来源于水果品种的固有特性；二级香气，由酵母在发酵过程中产生；三级香气(花香为主)，由酒体在成熟或陈酿过程中产生[12]。苹果酒中香气成分主要包括醇类、羰基化合物(醛和酮)、挥发酸、酯类等。由表2可知，香气物质含量变化较大。苹果酒发酵所用菌株的差异和香气物质含量测定方法(内标法和外标法)的不同可能是引起这种差异的主要原因。醛类物质主要来源于苹果汁，发酵后醛类物质的种类和含量均降低[13]。高级醇是由氨基酸和糖类在酵母发酵过程中通过Ehrlich途径产生[14]。3-甲基-1-丁醇(异戊醇)和2-苯乙醇是苹果酒中主要的高级醇[15-16]。QIN等[17]测定了14种英国和斯堪的纳维亚地区的苹果酒中的挥发性成分，结果表明酯类几乎占挥发性化合物总数的一半。风味活性的酯类主要是乙酸酯(乙酸乙酯、乙酸异戊酯等)和中链脂肪酸乙酯(己酸乙酯、辛酸乙酯等)[18]。乙酸酯是由相应高级醇的酯化反应产生；乙酯类是由乙醇和中链脂肪酸合成。陈酿期较短的果酒，乙酸乙酯对酒体的果味贡献较大[19]。适宜浓度的酯类，会赋予酒体愉悦的果香气味，但酯类含量过高会给果酒带来油漆或指甲油的异味，高浓度的乙酸乙酯还会抑制酒体的果香和花香[20]。

表2 苹果酒中的主要挥发性成分[15，17，21-24]Table 2 The major olatile components of apple ciders[15，17，21-24]

2.2 非挥发性成分

苹果酒中果糖含量为3.0～32.9 g/L，苹果酸含量为0.37～2.9g/L，柠檬酸含量为0.0～2.8 g/L[17,21]。苹果酸-乳酸转化前的苹果酒中，苹果酸是含量较高的有机酸[21]。苹果的抗自由基活性与总多酚含量密切相关[25]。羟基肉桂酸(1.5～5.3 mg/L)、黄烷醇和原花青素是苹果汁中的主要酚类[26-27]。儿茶素(8.13 mg/L)、表儿茶素(24.44 mg/L)、咖啡酸(20.72 mg/L)和绿原酸(14.43 mg/L)是苹果酒中主要的单酚物质[28]。原花青素是果酒收敛性口感的主要来源，其聚合度越高，酒体的苦味和涩味越重[11]。

3 苹果酒品质的影响因素

苹果的品种、成熟度、发酵菌种和发酵工艺等均会影响苹果酒的成分和感官品质。

3.1 苹果品种与成熟度的影响

依据苹果酸和单宁含量的不同，苹果分为4种类型：甜、苦甜、苦酸和尖酸。我国苹果品种多样，主要栽培品种有富士、嘎拉、金冠、元帅、红星等，杂交品种包括鲁加、寒富、赛金、瑞红等[29-30]。我国苹果大多为低酸度或低单宁含量的鲜食品种。国外苹果品种主要有Douce moet(甜麦)、Petit jaune(小黄)、Judaine(瑞丹)、Arolles(酸王)、Kermerrien(苦开麦)、Granny Smith(澳洲青苹)等。Golden delicious(金冠)、Jonagold(乔纳金)、Red delicious(红星)3个品种在欧洲的市场占有量超过70%；Douce moet、Petit jaune和Kermerrien是法国酿造苹果酒的常用品种；Judaine、Arolles和Granny Smith多用来生产果汁饮料[31]。苹果酒的主要原料包括鲜苹果、脱水苹果、苹果汁(浆)及浓缩苹果汁(浆)，根据中国果酒通用技术要求，原料以鲜苹果计的潜在酒精度不应小于2%。

LANZERSTORFER等[32]测定了奥地利88个苹果品种(主要为非商业化的古老品种)的成分特征，结果表明不同苹果品种有机酸(苹果酸和柠檬酸)、矿物质、磷酸盐、微量元素和多酚物质的含量都存在较大差异。此外，果实的成熟度也会影响苹果的成分组成。不同成熟度的苹果中可溶性固形物(主要是指可溶性糖类)含量为8.0～18.9 °Brix，苹果酸含量在0.13～17.2 g/L[32]。随着苹果的成熟度增加，糖类总含量显著增加，可滴定酸含量呈下降趋势[19]。未成熟苹果生产的苹果汁和苹果酒中酚类化合物含量高于成熟和过熟苹果，但酚类物质含量受苹果品种影响较大[27]。BRAGA等[19]测定了不同成熟度(未成熟、成熟和衰老)苹果的挥发性成分(酯类、醇类和醛酮类化合物)含量，发现成熟的嘎拉(Gala)苹果的香气物质总含量最高。BARREIRA等[1]发现苹果品种影响果渣中酚类化合物(酚酸、黄酮)的分布和含量，新鲜苹果渣中的酚类化合物主要是绿原酸(0.03～0.40 g/kg)、咖啡酸(0.02～0.28 g/kg)、(+)-儿茶素(0.12 g/kg)、(-)-表儿茶素(0.02～0.64 g/kg)、芦丁和槲皮素糖苷。

3.2 发酵菌种的影响

传统苹果酒的酿造是由存在于苹果表皮和环境中的微生物自发进行的发酵。苹果表皮中分离鉴定的酵母菌主要有酿酒酵母属(Saccharomyces)、汉逊酵母属(Hanseniaspora)和酒香酵母属(Brettanomyces)等[8]。COTON等[33]测定了法国苹果酒中的酵母种类，在分离到的208个菌株中鉴定出15种酵母(表3)。其中，贝酵母(Saccharomycesbayanus)占比最高，其次是酿酒酵母(Saccharomycescereisiae)。COUSIN等[8]综述了自然发酵的苹果酒中存在的细菌种类，主要包括乳杆菌科(Lactobacillaceae)、明串珠藻科(Leuconostocaceae)、孢子乳杆菌科(Sporolactobacilliaceae)和鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)等。苹果酒的自然发酵过程包括3个阶段：氧化过程、酒精发酵(酵母菌将可发酵糖转化为乙醇)和苹果酸-乳酸发酵(由乳酸菌主导，将苹果酸转化为乳酸)[34]。氧化过程是在非酿酒酵母作用下进行，主要产生果香和花香味的香气化合物[35]。酒精发酵过程中，酿酒酵母(Saccharomycescereisiae)是发酵的优势菌株[36]。西班牙苹果酒自然发酵过程中，非酿酒酵母的汉逊酵母属(Hanseniaspora)和美极梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)在发酵早期生长良好，但在随后的发酵阶段被酿酒酵母属的酵母取代；在发酵的初期和中期，贝酵母(Sacchamomycesbayanus)是优势菌种(33%～41%)，而发酵后期酿酒酵母(Sacchamomycescereisiae)则成为占主导地位的菌种[36]。传统苹果酒生产的发酵周期较长，主发酵需要几周，陈酿过程可能长达几个月，发酵过程不可控，容易受外界因素影响而使产品批次差异较大。

表3 法国苹果酒中鉴定的酵母种类[33]Table 3 Yeast species identified in French cider[33]

现代苹果酒生产工艺中通常采用加入纯种酵母进行酒精发酵。表4列举了可用于苹果酒发酵的菌种和发酵条件。发酵菌种的添加有助于控制苹果酒的发酵过程，同时由于异味成分(挥发酸、硫化物和有异味的酚类物质)的产生减少，使得苹果酒的品质得到提升[37]。酿酒酵母和贝酵母是目前工业苹果酒发酵最常用的酵母[38-39]。不同酵母菌种的使用主要

表4 苹果酒发酵菌种和发酵条件Table 4 Starter cultures and fermentation conditions of cider fermentation

影响果酒中黄酮类化合物和花青素的组成[40]。贝酵母发酵的苹果酒，其羟基肉桂酸衍生物(特别是对香豆酸)的含量高于酿酒酵母发酵的苹果酒，但酵母菌株对苹果酒酚类成分的影响程度低于加工过程、苹果品种或不同成熟度[27]。BEDRIANA等[41]比较了分离自西班牙本土酒窖的贝酵母与商业贝酵母在冰苹果酒发酵中的差异，结果表明本土菌株的甲醇、乙酸和乙酸乙酯产量更低。MASNEUF-POMARDE等[42]测定了28株贝酵母的葡萄汁酵母变种(Sacchamomycesbayanusar.uarum)与酿酒相关的表型特征，结果表明与酿酒酵母相比，该酵母具有更短发酵滞后期、更高细胞活力、更好的低温适应特性，可在13 ℃下完成酒精发酵[42]。

近年来，探究新菌种来提高苹果酒风味多样性成为研究热点。非酿酒酵母属酵母因具有生产低酒精含量果酒和改变苹果酒的香气组成的潜力，在酿酒行业受到越来越多的关注。CONTRERAS等[45]测定了50种非酿酒酵母属酵母的发酵能力，结果表明不同酵母对合成培养基的糖消耗率差异较大，糖耗量为0～68%。马克斯克鲁维酵母(Kluyeromycesmarxianus)已经作为生产乙酸乙酯、2-苯乙醇等香气化合物的工业菌株[46-48]，其分泌的内聚半乳糖醛酸酶具有较高的果胶酶活性[49-50]。ROLLERO等[51]研究表明马克斯克鲁维酵母具有良好的果酒发酵能力，且发酵过程中不会影响酿酒酵母的发酵特性。ZHANG等[24]比较了马克斯克鲁维酵母与酿酒酵母发酵的苹果酒的代谢组学差异，结果表明马克斯克鲁维酵母发酵的苹果酒具有更高含量的乙酸、乙酸乙酯和乙酸丙酯。与商业贝酵母相比，马克斯克鲁维酵母发酵的苹果酒的总酚和酯类(乙酸-3-甲基-1-丁酯、辛酸乙酯、己酸乙酯)含量更高[52]。

部分非酿酒酵母属酵母因其发酵能力较低，通常不能单独完成酒精发酵。通过与酿酒酵母或非酿酒酵母属酵母的混合接种，可以提高非酿酒酵母属酵母的果酒发酵能力[15]。已有研究的非酿酒酵母属酵母主要包括汉逊酵母属(Hanseniaspora)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyeromyces)、Brettanomyces属等[35，53-54]。克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyeri)和葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauarum)混合发酵的苹果酒，其葡萄糖和果糖含量显著低于克鲁维毕赤酵母单独发酵的苹果酒，挥发酸和醛类含量显著高于2种酵母单独发酵的苹果酒[13]。Metschnikowiapulcherrima与酿酒酵母的顺序接种能够提高果酒中高级醇和酯类的含量，且乙醇含量较低(体积分数0.9%～1.6%)[45]。马克斯克鲁维酵母与酿酒酵母混合发酵的果酒中2-苯乙醇和乙酸苯乙酯的产量高于酿酒酵母发酵的果酒[51]。此外，通过添加合适的营养物质(碳源、氮源)也可以改善非酿酒酵母属酵母的发酵能力[55]。GSCHAEDLER等[54]在苹果汁中添加不同浓度的镁、锌和氮，马克斯克鲁维酵母、克鲁维毕赤酵母、膜醭毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)的乙醇产量均显著增加，同时苹果酒挥发性成分的组成也发生了显著变化。

3.3 生产工艺的影响

苹果汁的前处理、发酵温度、外源物质的添加等均会影响苹果酒的成分和感官品质。

ROSEND等[56]探究了浓缩苹果汁与鲜榨苹果汁对苹果酒发酵和产品品质的影响，结果表明较高温度下(30 ℃)，酿酒酵母在浓缩果汁中的发酵速率稍慢，且对果糖的利用率降低；以浓缩果汁生产的苹果酒中长链脂肪酸酯(癸酸乙酯、十二酸乙酯)的含量更高。在冰苹果酒的生产中，相比低温浓缩，低温萃取制备的苹果汁酿造的果酒具有更高的糖酸比和糖多酚比，且果香味更浓郁，涩味更低[57]。苹果酒发酵过程中，温度会影响酵母菌代谢，进而影响苹果酒的香气组成。随着发酵温度的升高(17～20 ℃)，苹果酒的关键香气成分(乙酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、异戊醇、苯乙醇和3-甲硫基-1-丙醇等)含量显著增加，但过高的发酵温度(20～26 ℃)则会导致香气成分含量降低[58]。

研究人员尝试通过天然产物、外源酶的添加来提升酒体的风味，改善果酒的感官品质。XU等[28]发现在苹果汁中添加还原型谷胱甘肽能够降低苹果酒的色度值，保护绿原酸和根皮素，并能改变苹果酒的香气组成。在苹果汁中加入苹果渣酚类粗提物能够增加发酵后酒体的色度值和苦涩感，且槲皮苷含量增加可使苹果酒的抗氧化活性提升[59]。β-葡萄糖苷酶能够显著提高果酒中单萜的含量，起到改善果酒香气的作用[60]。O2和脂类的缺乏会抑制发酵过程中酵母的生长和对糖的消耗，从而导致发酵不完全。ARELA等[61]的研究表明脂(甾醇和不饱和脂肪酸)和O2的加入能够增加果酒中高级醇的含量，改变酯类物质和挥发性脂肪酸的组成。

4 结论及展望

欧洲是苹果酒的主要生产和消费地区，其苹果酒品类多样，且具有完善的苹果酒生产和销售体系。中国是世界第一大苹果种植国，但主要以鲜食品种为主；且苹果酒行业起步较晚，从酿酒苹果品种、发酵菌种、生产工艺到产品标准的建立还有待完善。苹果酒的成分主要包括挥发性香气物质和非挥发性的糖、有机酸和多酚化合物等。酯类是苹果酒中含量最高的香气成分，多酚类物质对苹果酒的口感起重要作用。与挥发性成分相比，苹果酒的非挥发性成分，尤其是多酚化合物的研究相对较少。苹果原料(品种和成熟度)、酿酒微生物和发酵温度等对苹果酒的品质有显著影响。

未来，风味多样性的提升和口感的优化，仍将是苹果酒的研究热点。以苹果为主要原料，加入果蔬、香料等可食用的天然原料进行混合发酵，是增加苹果酒品类多样性的方式。专用酿酒苹果品种的筛选、多菌种的混合发酵以及特定的发酵温度、时间等对苹果酒品质的影响需要进一步的探究。微生物细胞工厂对于苹果成分的转换作用，微生物之间的相互作用对苹果酒品质的影响也应得到更多关注。此外，发酵过程中特殊功能性成分的变化及其代谢机制的研究，将有助于理解酒体的色、味、气以及成分的产生，为更好地控制酿酒过程提供指导。