不同产地及品种金银花中绿原酸和木犀草苷含量测定

刘杨，包华音，张峰

（1.山东中医药大学，山东济南250355；2.山东省农业科学院，山东济南250100）

不同产地及品种金银花中绿原酸和木犀草苷含量测定

刘杨1，包华音1，张峰2，*

（1.山东中医药大学，山东济南250355；2.山东省农业科学院，山东济南250100）

测定不同产地、品种金银花中绿原酸和木犀草苷的含量。按照2010年版《中国药典》金银花项下规定的HPLC法分别测定各样品中绿原酸和木犀草苷的含量。结果表明13个不同产地来源、品种的金银花中绿原酸和木犀草苷的含量分别在2.23%～3.16%和0.085%～0.193%范围内，均符合药典标准。山东平邑来源金银花的绿原酸和木犀草苷含量明显高于其它产地，其中，以平邑地产金银花质佳。结论：不同产地来源、品种的金银花质量有一定差异，在引种栽培时应选择优良品种。本研究结果可为金银花引种栽培和人工培育提供参考依据。

金银花；绿原酸；木犀草苷；HPLC；含量测定

金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花，味甘性寒，具有清热解毒，疏散风热的功效，主要用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热等症的治疗［1］。研究表明，有机酸类和黄酮类化合物为金银花的主要有效成分［2］，具有抗菌、抗病毒、增强免疫、抗肿瘤、解热抗炎、保肝利胆、抗氧化等多种药理作用［3-5］。2010版《中国药典》规定以绿原酸和木犀草苷作为金银花的质控成分。本研究通过HPLC方法测定不同产地来源、不同品种的金银花栽培品中绿原酸和木犀草苷的含量，以期筛选出章丘龙山基地生长的优质金银花种质资源，为金银花药材的质量评价提供实验依据。

1仪器与试剂

1.1 仪器

日立L-2000高效液相色谱仪（安捷伦进样器、L-2400紫外检测器、D-2000elite色谱工作站）；Sartorius CP225D电子天平（d=0.01mg）；数显式电热恒温干燥箱：上海阳光实验仪器有限公司；超声清洗仪：昆山市超声清洗有限公司；Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；DIKMA苯基硅烷键合硅胶柱（Inertsil PH-3，250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 试剂

甲醇（国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号：T20111220）；甲醇（国药集团化学试剂有限公司，色谱纯，批号：T20110727）；娃哈哈纯净水；乙腈（国药集团化学试剂有限公司，色谱纯，批号：20120206）；绿原酸（MUST-12031401）；木犀草苷（MUST-12041703）。

1.3 药材

药材于2013年5月23日采自山东省济南市章丘龙山基地，经山东中医药大学生药系李峰教授鉴定为金银花。药材详细信息见表1。将药材干燥后粉碎，过四号筛，备用。

2方法与结果

2.1 色谱条件

绿原酸色谱条件：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）；检测波长为327 nm；流速1 mL/min，柱温为室温；进样量为20 μL，理论板数按绿原酸峰计算应不低于1000。

表1 不同产地及品种的金银花药材Table 1Lonicera japonica of different habitats and kinds

木犀草苷色谱条件：苯基柱（InertsilPH-3，250mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈为流动相A，以0.5%冰醋酸溶液为流动相B，按下列条件进行梯度洗脱：0 min～15 min，A（10%～20%），B（90%～80%）；15 min～30 min，A（20%），B（80%）；30 min～40 min，A（20%～30%），B（80%～70%）。检测波长为350 nm，流速1 mL/min，柱温为室温；进样量为20 μL，理论板数按木犀草苷峰计算应不低于20 000。

2.2 对照品溶液的制备

分别称取一定量的绿原酸和木犀草苷对照品置于10 mL棕色容量瓶中，绿原酸对照品加入一定量50%甲醇使溶解，木犀草苷对照品加入70%乙醇使溶解，超声一段时间，然后再用各自的溶剂补足至刻度，摇匀，最后制成绿原酸40 μg/mL，木犀草苷40 μg/mL作为对照品溶液。

图1 绿原酸标准品（A）和木犀草苷标准品（B）的HPLC图谱Fig.1HPLC chromatogram of chlorogenic acid standard（A）and luteoloside standard（B）

2.3 供试品溶液的制备

绿原酸供试品溶液的制备：精密称定药材粉末0.25 g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25 mL，称定重量，超声提取30 min，称重并用50%甲醇补足失重，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 mL，置25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

图2 绿原酸供试品（C）和木犀草苷供试品（D）的HPLC图谱Fig.2HPLC chromatogram of chlorogenic acid sample（C）and luteoloside sample（D）

木犀草苷供试品溶液的制备：精密称定药材粉末1 g，置具塞锥形瓶中，加入70%乙醇25 mL，称定重量，超声提取1 h，称重并用70%乙醇补足失重，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，回收溶剂至干，残渣用70%乙醇溶解，转移至5 mL容量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。

2.4 标准曲线的绘制

绿原酸标准曲线绘制：配制浓度分别为10、20、32、40、80、100 μg/mL的绿原酸对照品溶液，按“2.1”色谱条件测定，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，得回归方程Y=2 937.4X-147.89（r=0.99 98），绿原酸浓度在10 μg/mL～160 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

木犀草苷标准曲线绘制：配制浓度分别为10、30、40、50、60、80μg/mL的木犀草苷对照品溶液，按“2.1”色谱条件测定，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，得回归方程Y=2.8×106X-22 845（r=0.999 7），木犀草苷的浓度在10 μg/mL～80 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.5 精密度试验

取“2.2”中配制的木犀草苷和绿原酸的对照品溶液，连续进样6次，每次20 μL，测定峰面积。计算其保留时间的RSD值分别为0.58%和0.71%，峰面积的RSD值分别为1.68%和0.31%。

2.6 稳定性试验

取9号样品的木犀草苷供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12 h进样，每次20 μL，测定峰面积，结果保留时间和峰面积的RSD值分别为1.26%、1.68%。取10号样品的绿原酸供试品溶液，在0、2、4、6、8、12 h进样，每次20 μL，测定峰面积，结果保留时间和峰面积的RSD值分别为1.29%、1.96%。

2.7 重现性试验

取8号样品的木犀草苷供试品溶液，13号样品的绿原酸的供试品溶液，分别进样6次，每次20 μL，测定峰面积，结果保留时间RSD值分别为1.23%、0.52%，峰面积RSD值分别为1.76%、1.27%。

2.8 加样回收率试验

取已测知木犀草苷和绿原酸含量的样品6份，精密称定，再准确加入一定量的木犀草苷和绿原酸的对照品，加入相应的溶剂，按照“2.3”中的方法提取并测定，计算加样回收率，结果见表2和表3。

表2 绿原酸的加样回收率试验结果（n=6）Table 2The recovery test results of chlorogenic acid（n=6）

表3 木犀草苷的加样回收率试验结果（n=6）Table 3The recovery test results of luteoloside（n=6）

2.9 绿原酸和木犀草苷的含量测定

对下列13个不同产地和品种的金银花药材分别按照“2.3”方法提取绿原酸、木犀草苷供试品溶液，按照“2.1”中的色谱条件，测定样品中绿原酸和木犀草苷的含量，结果见表4。

表4 不同产地、品种金银花栽培品绿原酸、木犀草苷的含量测定Table 4Chlorogenic acid and luteoloside content determination of Lonicera japonica of different habitats and kinds

3讨论

2010年版《中国药典》金银花项下规定按干燥品计，含绿原酸不得低于1.5%，含木犀草苷不得低于0.050%。本研究中不同产地来源和品种的金银花中绿原酸和木犀草苷的含量分别在2.23%～3.16%和0.085%～0.193%范围内，均显著高于药典标准，均为质优的药材。

本研究中，以绿原酸的含量为指标计算，13号平邑金银花含量最高，其次是平邑地产金银花（7号）和平邑大毛金银花（6号）产的金银花。以木犀草苷含量为指标计算，7号平邑地产金银花含量最高，其次是平邑树型金银花（8号）、平邑鸡爪花（10号）、平邑四季金银花（9号）。山东和河南是金银花的主产地，通常认为金银花以山东产量大，而以河南品质佳［6］。但从本研究结果可见，山东平邑来源的金银花质量明显优于其它产地。

金银花是临床常用中药材和药食同源中药，有着光明的开发前景，市场潜力巨大，已由单一药用向饮料、保健食品、日用化工等领域发展。金银花的品质受到生长环境、栽培技术、采收季节、加工方法、储存条件等多种因素的影响［7］。此外，金银花原植物的种内变异很大，在植物形态、有效成分含量等方面有较明显的差异［8］。本研究统一选取济南市章丘龙山基地生长的金银花，其中，以平邑地产金银花的绿原酸和木犀草苷含量较高，因此，可初步确定山东平邑地产金银花质佳。可见，不同栽培品种的金银花质量有一定差异，所以在引种时应考虑优良品种。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：205

［2］邢俊波，李会军，李萍，等.忍冬花蕾化学成分研究［J］.中国新药杂志，2002，11（11）：856

［3］王力川.金银花的化学成分及功效研究进展［J］.安徽农业科学，2009，37（5）：2036-2037

［4］夏远，李弟灶，裴振昭，等.金银花化学成分的研究进展［J］.中国现代中药，2012，14（4）：26-32

［5］关炳峰，谭军，周志娣.金银花提取物的抗氧化作用与其绿原酸含量的相关性研究［J］.食品工业科技，2007，28（10）：127-129

［6］王天志.金银花的研究进展［J］.华西药学杂志，2000，15（4）：292

［7］李红霞，王雪芹，李振国，等.不同产地金银花与山银花主要成分的含量比较［J］.中国药房，2011，22（31）：2935-2937

［8］宋平顺，卫玉玲，陶耀武，等.不同产地金银花中绿原酸和木犀草苷含量的HPLC法测定［J］.甘肃中医学院学报，2008，25（5）：31-34

Determination of Chlorogenic Acid and Galuteolin in Lonicera japonica of Different Kinds and Sources by HPLC

LIU Yang1，BAO Hua-yin1，ZHANG feng2，*
（1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji'nan 250355，Shandong，China；2.Shandong Academy of Agricultural Sciences，Ji'nan 250100，Shandong，China）

To determine the content of chlorogenic acid and galuteolin in Lonicera japonica of different kinds and sources.The content of chlorogenic acid and galuteolin in Lonicera japonica were determined by HPLC according to the Chinese pharmacopoeia ordains.The contents of chlorogenic acid and galuteolin in Lonicera japonica of different kinds and sources were 2.23%-3.16%and 0.085%-0.193%respectively，which were allaccordance with pharmacopeia's standard.The quality of Lonicera japonica from Shandong pingyi was obviously superior to other habitats，and that of Pingyi dichan was the best.There was difference in the quality of Lonicera japonica of different kinds and sources.The study provides

for artificial cultivation and quality evaluation of Lonicera japonica.

Lonicera japonica；chlorogenic acid；luteoloside；HPLC；content determination

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.09.030

2013-12-23

山东省农业良种工程项目（2011LZ01-03）

刘杨（1981—），女（汉），本科，研究方向：中药资源与质量控制。

*通信作者：张锋（1979—），女，副研究员，博士，从事药用植物育种与栽培研究。