双孢菇废弃菇柄核酸超声提取工艺优化

李顺峰，沈琪，，谢新华，王安建，*，侯传伟，魏书信

（1.河南省农科院农副产品加工研究所，河南郑州450002；2.河南农业大学食品科学技术学院，河南郑州450002）

双孢菇废弃菇柄核酸超声提取工艺优化

李顺峰1，沈琪1，2，谢新华2，王安建1，*，侯传伟1，魏书信1

（1.河南省农科院农副产品加工研究所，河南郑州450002；2.河南农业大学食品科学技术学院，河南郑州450002）

为了提高核酸得率，增加双孢菇废弃菇柄的经济价值。本文以双孢菇废弃菇柄为原料，通过单因素试验研究了超声功率、超声工作/间歇时间、超声时间、液固比对核酸提取的影响，并采用响应面法对核酸超声提取工艺进行优化。结果表明，在单因素试验结果基础上，再采用响应面分析法对主要工艺参数进行优化，得到双孢菇废弃菇柄中核酸提取最优工艺参数为：超声功率580 W，液固比34∶1 mL/g，超声时间15 min，理论核酸得率3.49 g/100 g。通过验证试验，实际核酸得率可达3.43 g/100 g，实验证明模型拟合程度良好，误差较小。与传统工艺相比，超声波提取核酸不仅快速高效，且反应过程无物料损失和无副反应发生，是一种安全、经济和简便的提取方法。

双孢菇废弃菇柄；核酸；超声提取；响应面分析法

双孢菇（Agaricus bisporus）属伞菌目蘑菇科蘑菇属大型真菌，具有较高的营养价值和药用价值［1-3］，享有“素中之王”的美称，是我国目前出口量最大、创汇最高的一种食用真菌。然而，在双孢菇加工过程中大量的菇柄作为废弃物被丢弃，既污染环境又造成了资源的浪费。双孢菇菇柄与其菇盖一样富含蛋白质、氨基酸、多糖、核酸、核苷酸等成分［2，4-5］，因此对废弃菇柄进行综合开发利用，可提高双孢菇的采后价值。

目前，国内外对双孢菇的研究大多是多糖、蛋白、脂肪等有效成分的提取、分离及功能性质的测定，对于双孢菇核酸和核苷酸方面的研究还比较少。核酸是一种生物大分子物质，可分为脱氧核糖核酸和核糖核酸［6］，核酸酶解后的核苷酸是食用菌中主要的呈味物质。测定核酸的方法有定磷法［7］、地衣酚法［8］、紫外吸收法［8］、荧光光度法［9］、高效液相色谱法［10］、毛细管电泳法［11］等。定磷法准确性好，灵敏度高，最低可以测到10 ug/mL核酸的水平［1］。近年来，超声波技术广泛应用于植物中的蛋白质、酶、多糖、生物碱、蒽醌、油脂、黄酮类、苷类等生物活性物质的提取［12-16］，其原理是超声波处理过程中，“空化效应”释放巨大能量，产生高达几百个大气压的局部瞬间压力，形成冲击波，使固体表面及液体介质受到极大的冲击力，能量足以使细胞破裂以达到破壁的目的［12］，使溶剂能和植物中的有效成分充分接触，有利于有效成分向提取溶剂转移，提高提取效率。该方法操作简单，副产品少，提取物易分离，不破坏有效成分能达到比常规提取法更理想的结果。因此，本实验以双孢菇菇柄为原料，采用超声法提取菇柄中核酸，定磷法测定核酸含量，以研究菇柄核酸提取率的最佳工艺。

1材料与方法

1.1 材料与试剂

双孢菇废弃菇柄购于长垣；磷酸二氢钾、浓硫酸、氯仿、钼酸铵、抗坏血酸、硝酸、30%过氧化氢、无水乙醇等均为国产分析纯；试验用水均为蒸馏水。

1.2 仪器

GZX-9140MBE型数显鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂提供；万能粉碎机：上海金刚电器厂；精密电子天平：常州万泰天平仪器有限公司；H2050R型高速冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司提供；UV-2802型紫外可见分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司；HH-S4数显恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂；HN-1000Y超声波细胞粉碎机：上海汗诺仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核酸的定量测定［17］

1.3.1.1 标准磷溶液

精密称取在105℃烘至恒重的磷酸二氢钾0.877 5 g，溶于少量蒸馏水中，转移至500 mL容量瓶中，加入5 mL 5 mol/L硫酸溶液及氯仿数滴，用蒸馏水稀释至刻度，此溶液每毫升含磷400 μg。临用时准确稀释20倍（20 μg/mL）。

1.3.1.2 定磷试剂

17%硫酸∶2.5%钼酸铵∶10%抗坏血酸∶水=1∶ 1∶1∶2，临用时按顺序配制，当天配制当天使用。

1.3.1.3 磷标准曲线的绘制

取12支干试管，分别吸取标准磷溶液0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，相当于每份的磷含量分别为0、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μg，加水补至3 mL，摇匀至45℃水浴中保温10 min，冷却至室温，于660 nm处测吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线（图1），回归方程为：y=0.045 6x-0.001 4（R2=0.999 9）。

图1 磷标准曲线Fig.1Phosphorus standard curve

1.3.1.4 无机磷的测定

吸取样液1.0 mL，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取3.0 mL置于试管中，加定磷试剂3.0 mL，45℃水浴保温10 min，冷却，测A660nm。依据标准曲线计算磷含量。

1.3.1.5 总磷的测定

取样液1.0 mL于试管中，再加1.0 mL浓硫酸，放入150℃的烘箱中消化，在溶液变黑之后各滴加两滴HNO3和30%的H2O2，继续消化至透明，表明消化完成。冷却至室温后将消化液移入100 mL容量瓶中，并定容至刻度，其余步骤同1.3.1.4。

1.3.1.6 计算

样品中核酸得率按下式计算［7］。

式中：m1为样品中有机磷含量，μg，有机磷含量=总磷含量－无机磷含量；m为样品重量，g；N为稀释倍数；11为1 μg磷相当于11 μg核酸。

1.3.2 双孢菇废弃菇柄核酸的提取

精确称取干燥粉碎后的菇柄粉2.0 g，按一定液固比加入蒸馏水后进行超声处理，提取一定时间后以4 500 r/min离心10min，取上清液测定核酸含量。

1.3.3 单因素实验

以双孢菇废弃菇柄为材料，考察不同超声功率（200、300、400、500、600、700、800 W）、液固比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g）、超声工作/间歇时间（1、2、3、4、5 s）、超声时间（5、10、15、20、25、30 min）对废弃菇柄核酸提取效果的影响，每个条件进行3次重复。

1.3.4 响应面分析实验

根据Central Composite中心复合试验设计原理和单因素试验结果，选取超声功率、液固比、超声时间3个因素，各取3个水平，进行3因素3水平共20个试验点的响应面分析试验，并运用Design Expert 7.0数据统计分析软件进行数据分析，进而得到最佳的生产工艺条件，因素水平见表1。

表1 因素水平编码表Table 1Factors and code levels of experiments

2结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声功率对双孢菇废弃菇柄核酸提取的影响

在液固比30∶1 mL/g，超声工作/间歇时间3 s，超声功率分别为200、300、400、500、600、700、800 W下超声10 min结果如图2所示。

图2 超声功率对双孢菇废弃菇柄核酸得率的影响Fig.2Effect of ultrasonic power on the yield of nucleic acids from Agaricus bisporus waste stipe

超声功率从200 W到600 W，双孢菇废弃菇柄核酸得率不断增加，并在600 W时达到最大3.21 g/100 g；当超声功率大于600 W时，核酸得率反而下降，可能在超声功率过大时，破坏核酸的分子结构从而导致核酸得率下降。

2.1.2 液固比对双孢菇废弃菇柄核酸提取的影响

在超声功率600 W，超声工作/间歇时间3 s，液固比为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g下超声10 min，结果见图3。

由图3可知，随着液固比的增加，核酸得率增大，且各个水平之间效果显著，但随着液固比的增加，后续浓缩工艺需要更长的时间。综合考虑，选取液固比为30∶1mL/g。

图3 液固比对双孢菇废弃菇柄核酸得率的影响Fig.3Effect of ratio of liquid to solid on the yield of nucleic acids from Agaricus bisporus waste stipe

2.1.3 超声工作/间歇时间对双孢菇废弃菇柄核酸提取的影响

在超声功率600 W，液固比30∶1 mL/g，超声工作/间歇时间分别为1、2、3、4、5 s下超声10 min，测定结果如图4所示。

图4 超声工作/间歇时间对双孢菇废弃菇柄核酸得率的影响Fig.4Effect of ultrasonic work-pause time on the yield of nucleic acids from Agaricus bisporus waste stipe

随着超声工作/间歇时间的延长核酸得率呈增大的趋势，但各时间之间效果并不显著，所以选取5 s为最优条件。

2.1.4 超声时间对双孢菇废弃菇柄核酸提取的影响

在超声功率600 W，液固比30∶1 mL/g，超声工作/间歇时间5 s下，分别超声5、10、15、20、25、30 min，核酸测定结果如图5所示。

图5 超声时间对双孢菇废弃菇柄核酸得率的影响Fig.5Effect of ultrasonic time on the yield of nucleic acids from Agaricus bisporus waste stipe

从图5可以看出，随着超声时间的延长，核酸得率逐渐增大，在超声时间达20 min时达到最大，之后降低。这可能是随着超声时间的延长，产生较多的热量，造成核酸的破坏，从而导致得率的降低，这与崔茉莉［18］等研究的微波时间过长，热效应造成核糖核酸类物质得率降低相一致。在超声时间由5 min延长至10 min时，核酸得率由2.13 g/100 g增加到3.11 g/100g，达到显著水平，之后再延长超声时间（至20min），核酸得率增加缓慢，与超声10 min时无显著差异，因此选择超声时间为10 min。

2.2 响应面法优化双孢菇废弃菇柄核酸提取工艺参数2.2.1响应面试验结果

根据单因素实验结果，以核酸得率（Y）为考察目标做响应面分析，试验设计及结果见表2。

表2 试验设计及结果Table 2Design and results of experiments

2.2.2 回归方程的方差分析

用Design Expert 8.0数据分析软件对表2数据进行回归拟合，得到双孢菇菇柄核酸提得率Y对A、B、C的回归方程为：

对该模型进行显著性检验，结果见表3。模型p＜0.01，表明该二次方程模型比较显著。失拟项不显著（p＞0.05），方程拟合较好，可以对不同条件下的核酸提取得率进行预测。从F值A、B、C可以看出，在所选的因素水平范围内，对双孢菇菇柄核酸得率的影响顺序为超声时间＞液固比＞超声功率。模型中一次项C，二次项B、C处于极显著水平；一次项B，二次A，交互项BC处于显著水平；一次项A，交互项AB、AC不显著。两因素间交互作用分析的响应面见图6。

图6表示超声功率600 W，液固比和超声时间对核酸得率的影响。当超声时间小于10 min时，核酸得率随液固比的增加先增大后减小；当超声时间大于10 min时，核酸得率随液固比的增加而增大。当液固比一定时，核酸得率随超声时间的延长而增加，当超声时间在5 min～10 min范围时，随着超声时间的延长，核酸得率增加较快；当超声时间在10 min～15 min范围时，随着超声时间的延长，核酸得率增加较慢。

表3 试验结果方差分析表Table 3Variance analysis of experimental results

图6 液固比与超声时间对核酸得率的交互作用Fig.6Interaction of liquid to solid and ultrasonic time on the yield of nucleic acid

2.3 验证实验

运用Design Expert 8.0软件的响应面优化设计对试验结果进行优化，考虑到试验操作的便利，将最优提取条件调整为超声功率580 W，液固比34∶1 mL/g，超声时间15 min，预测双孢菇废弃菇柄核酸的得率为3.49 g/100 g。为检验响应面法所得结果的可靠性，采用上述优化条件，经3次平行试验，实际得率分别为3.34、3.46、3.49 g/100 g，实际得率平均值为3.43g/100g。与预测值相比，其相对偏差约为0.87%，说明该模型能较好地模拟和预测双孢菇废弃菇柄核酸得率。

3讨论与结论

3.1 讨论

目前常用于提取核酸的方法主要有：氨法［19］和浓盐法［20］。选取氨法提取条件［21］：氨质量浓度1%，破壁温度60℃，破壁时间60 min，原料质量浓度10%；浓盐法提取条件［21］：盐质量浓度10%，破壁温度95℃，破壁时间120 min，原料质量浓度10%。采用上述提取条件，经3次平行试验，氨法所得核酸得率为2.92 g/100 g，浓盐法所得核酸得率为2.04 g/100 g。氨法提取所得核酸的颜色较深，且纯度远小于另外两种方法；浓盐法则由于加入NaCl，需要在实验后期进行脱盐处理，从而导致实验过程过于繁琐，且提取率也远低于其他方法。虽然超声提取过程中会产生热效应，但双孢菇废弃菇柄的得率为3.43 g/100 g，仍高于前2种方法，说明热效应的强弱与超声波作用的参数及作用的对象密切相关［22］。故与传统工艺相比，超声波提取操作简单、安全、高效、快速，反应过程无物料损失和无副反应发生，可用于多种有效物质提取。

3.2 结论

1）利用超声波法提取双孢菇菇柄中的核酸，通过单因素试验得到，超声功率600 W，液固比30∶1 mL/g，超声工作/间歇时间5 s，超声时间10 min时核酸得率最显著，再采用响应面分析法对主要工艺参数进行优化，得到最优工艺参数为：超声功率580 W，液固比34∶1 mL/g，超声时间15 min，通过响应面分析可知，对双孢菇废弃菇柄核酸得率的影响顺序为超声时间＞液固比＞超声功率，理论核酸得率3.49 g/100 g。通过验证试验，实际核酸得率可达3.43 g/100 g，与预测值相比，其相对偏差约为0.87%，说明该模型能较好地模拟和预测双孢菇废弃菇柄核酸得率。

2）与传统提取核酸的氨法和浓盐法相比，超声波提取操作简单、高效、快速，反应过程无物料损失和无副反应发生，可用于多种有效物质提取。

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Optimization of Ultrasonic Extraction of Nucleic Acid from Agaricus bisporus Waste Stipe

LI Shun-feng1，SHEN Qi1，2，XIE Xin-hua2，WANG An-jian1，*，HOU Chuan-wei1，WEI Shu-xin1
（1.Institute of Agro-products Processing，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，Henan，China；2.Institute of Food Science and Technology，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，Henan，China）

To improve the yield of nucleic acid，increase the economic value of Agaricus bisporus waste stipe. Nucleic acid were extracted from Agaricus bisporus waste stipe by ultrasonic extraction.The effects of ultrasonic power，ultrasonic work/time，ultrasonic time，ratio of liquid to solid on the yield of nucleic acid were investigated by single factor experiments，and optimized the parameters by response surface analysis.The results showed that on the basis of single factor experiments，the parameters of ultrasonic extraction optimized by response surface analysis were as follows：ultrasonic power 580 W，liquid-solid ratio 34∶1 mL/g，ultrasonic time 15 min.Under these optimum conditions，the yield of nucleic acid extract from Agaricus bisporus waste stipe can be up to 3.43 g/100 g of which slightly lower than the theoretical yield（3.49 g/100 g）.This results indicated that the regression model could predict the yield of nucleic acid of from Agaricus bisporus waste stipe well.As compared with the traditional process，the ultrasonic extraction of nucleic acid，not only fast and efficient，but also no material loss and adverse reaction process，was a kind of security，economic and simple extraction method.

Agaricus bisporus waste stipe；nucleic acid；ultrasonic extract；response surface analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.09.013

2013-12-29

河南省重大科技攻关计划项目（112101110300）

李顺峰（1982—），男（汉），博士，主要从事农产品贮藏与加工研究。

*通信作者：王安建（1969—），男（汉），副研究员，硕士，研究方向：农产品加工与贮藏保鲜。