皱皮木瓜皮渣齐墩果酸和熊果酸提取工艺优化研究

蔡　娟，刘世尧，韦正鑫，张　丹，潘雪珍，卞京军，白志川（西南大学园艺园林学院，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆400715）

皱皮木瓜皮渣齐墩果酸和熊果酸提取工艺优化研究

蔡娟，刘世尧，韦正鑫，张丹，潘雪珍，卞京军，白志川*
（西南大学园艺园林学院，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆400715）

优化利用皱皮木瓜鲜果皮渣进行齐墩果酸和熊果酸最佳提取工艺条件。在单因素实验基础上，通过正交实验设计优化皱皮木瓜鲜果皮渣齐墩果酸和熊果酸提取的最佳工艺条件，利用高效液相色谱法进行目标性成分指标检测。实验结果表明，皱皮木瓜鲜果皮渣齐墩果酸和熊果酸的最佳工艺为95%乙醇，料液比1∶15g/mL，提取时间50min，提取温度70℃，此条件下齐墩果酸和熊果酸的总提取率为1.607%。本实验所得工艺方法稳定可靠、操作简单，可以为皱皮木瓜皮渣进行齐墩果酸和熊果酸工业化生产提供参考数据。

高效液相色谱，齐墩果酸，熊果酸，皱皮木瓜

皱皮木瓜为蔷薇科木瓜属植物贴梗海棠的果实，味酸、性温，入肝、脾经，有平肝和胃、去湿舒筋的功效［1］。临床用以治疗吐泻转筋、湿痹、脚气、水肿、痢疾等症。皱皮木瓜化学成分的研究表明［2-3］，富含超氧化物歧化酶、五环三萜有机酸类的齐墩果酸和熊果酸、抗坏血酸、黄酮类物质、鞣质、皂甙等成分。近年来随着重庆皱皮木瓜鲜果加工业的发展，生产超氧化物歧化酶后的鲜果皮渣排放量也在逐年增加，造成了原料的大量浪费。而目前我国对皱皮木瓜皮渣的开发缺少有效的手段，不仅影响了果业的可持续发展，也造成了环境的污染［4］。

齐墩果酸（oleanic acid，OA）和熊果酸（ursolic acid，UA）是皱皮木瓜的主要活性成分［5］。齐墩果酸是五环三萜类有机酸化合物，分子式为C30H48O3，具有消炎抑菌、降低转氨酶的作用，还有促进肝细胞再生、防止肝硬化、强心、利尿、降血脂、降血糖、增强有机体免疫功能、抑制变态反应等作用，是当前治疗肝炎的有效药物之一，近年又证明有抗癌活性。熊果酸是齐墩果酸的同分异构体，药理研究证明其具有显著的抗癌、促进免疫、降血脂和降血糖功效［6-7］。二者结构复杂，尚无化学合成品，主要靠从天然植物中提取获取，近年来有关齐墩果酸和熊果酸的提取已成为天然产物加工领域的热点研究之一［8-9］。

王志芳等［10］用高效液相色谱法测定了回流法对齐墩果酸和熊果酸提取工艺研究，而本实验以皱皮木瓜鲜果皮渣为原料，采用单因素实验和正交实验方法结合对皱皮木瓜齐墩果酸和熊果酸的提取工艺进行优化，旨在确定其最佳的提取工艺，为重庆皱皮木瓜鲜果皮渣的有效开发利用提供理论支撑。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

皱皮木瓜皮渣于2013年9月中旬取自重庆盛木生物科技有限公司加工车间，经重庆市西南大学园艺园林学院白志川教授鉴定为蔷薇科木瓜属植物皱皮木瓜（Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai）成熟果实超氧化物歧化酶提取皮渣；齐墩果酸（110709-200505）、熊果酸（110742-200516）标准品纯度99%以上，HPLC级，购于中国食品药用检定研究院；95%乙醇、甲醇、磷酸均为化学纯。

DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱上海齐欣科学仪器有限公司；FE-10高速药材粉碎机浙江温岭市百乐粉碎设备厂；KQ-5200DE型数控超声波清洗机昆山超声仪器有限公司；TDL-5A型台式离心机上海哈菲尔分析仪器有限公司；Molgene210a型超纯水机上海摩尔科学仪器有限公司；Mettler Toledo万分之一电子天平瑞士梅特勒-托利多公司；Waters e2695高效液相色谱仪沃特世科技（上海）有限公司。

1.2实验方法

1.2.1供试品溶液制备方法皱皮木瓜SOD提取残渣→45℃恒温鼓风干燥至恒重→粉碎15min→过80目筛→齐墩果酸和熊果酸提取→HPLC检测

1.2.2标准品溶液制备方法精密称取11.8mg齐墩果酸标准品和12.6mg熊果酸标准品，10mL容量瓶甲醇定容，每1mL中含有齐墩果酸1.18mg和熊果酸1.26mg。精密吸取该液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。按上述色谱柱进样，根据成峰保留时间定性，根据峰面积值绘制标准曲线。

1.2.3HPLC色谱检测方法色谱条件：Waters e2695型高效液相色谱仪，Waters 2998型二极管阵列检测器，Empower 2色谱工作站。色谱柱：Waters SunFire C18柱（4.6mm×150mm，5μm）；流动相为甲醇-0.1%磷酸（90∶10，V/V）［11］；流速1mL·min-1；柱温30℃；检测波长210nm；流量0.8mL·min-1；进样量10μL。

1.2.4OA和UA提取工艺优化方法

1.2.4.1单因素提取工艺优化

a.提取方法的优化精密称取木瓜残渣1.000g，分别用浸提法、渗漉提取法、回流提取法、超声波辅助提取等方法，95%乙醇，料液比1∶20，提取温度30℃，提取40min，提取两次，合并滤液，0.22μm微孔尼龙66型有机微孔滤膜过滤，按照1.2.3进行HPLC检测，三次重复，根据回归方程计算齐墩果酸和熊果酸总提取率。

b.提取溶剂浓度的优化精密称取木瓜残渣1.000g，分别用80%乙醇、85%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、99%甲醇，料液比1∶20，30℃，超声波辅助提取40min，提取两次，合并滤液，0.22μm微孔尼龙66型有机微孔滤膜过滤，按照1.2.3进行HPLC检测，三次重复，根据回归方程计算齐墩果酸和熊果酸总提取率。

c.料液比的优化精密称取木瓜残渣1.000g，用95%乙醇，分别按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，30℃，超声波辅助提取40min，提取两次，合并滤液，0.22μm微孔尼龙66型有机微孔滤膜过滤，按照1.2.3进行HPLC检测，三次重复，根据回归方程计算齐墩果酸和熊果酸总提取率。

d.提取时间的优化精密称取木瓜残渣1.000g，用95%乙醇，料液比1∶20，30℃条件下分别提取20、30、40、50、60、70、80min，提取两次，合并滤液，0.22μm微孔尼龙66型有机微孔滤膜过滤，按照1.2.3进行HPLC检测，三次重复，根据回归方程计算齐墩果酸和熊果酸总提取率。

e.提取温度的优化精密称取木瓜残渣1.000g，用95%乙醇，料液比1∶20，分别按30、40、50、60、70、80℃，超声波辅助提取40min，提取两次，合并滤液，0.22μm微孔尼龙66型有机微孔滤膜过滤，按照1.2.3进行HPLC检测，三次重复，根据回归方程计算齐墩果酸和熊果酸总提取率。

1.2.4.2正交实验设计优化在单因素考察基础上，在超声波辅助提取条件下，分别以乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度4个因素为考察对象，以齐墩果酸和熊果酸总提取率为考察指标，采用L9（34）正交设计，通过正交实验以优化提取工艺。4因素3水平正交实验设计表如下：

表1　齐墩果酸和熊果酸正交实验设计因素水平表Table 1　The orthogonal designing factors and levels table for OA and UA

1.2.5数据处理供试品进样得到齐墩果酸和熊果酸峰面积，根据齐墩果酸和熊果酸的回归方程分别计算齐墩果酸和熊果酸的提取率，然后相加就得齐墩果酸和熊果酸的总提取率。即公式：：齐墩果酸提取率（％）=（AU-13324）V/5000000，熊果酸提取率（％）=（AU-10756）V/4000000，AU表示样品峰面积值；V表示合并后滤液体积。三次取平均值就得最后齐墩果酸和熊果酸的总提取率，然后用Excel绘制曲线。

标准偏差：计算出三次齐墩果酸和熊果酸的总提取率，然后在Excel中工具栏“公式”中STDEV进行计算，就得到标准误差，然后绘制误差线。

2　结果与分析

2.1齐墩果酸和熊果酸标准曲线

以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，齐墩果酸的回归曲线如图1所示，其线性回归方程为：Y=5000000X+13324，R2=0.9830。结果表明齐墩果酸在进样浓度0.059～0.296mg·mL-1范围内，峰面积和样品浓度的线性关系良好。熊果酸的标准曲线如图2所示，其线性回归曲线为：Y=4000000X+10756，R2=0.9920。结果表明熊果酸在进样浓度0.0315～0.315mg·mL-1范围内，峰面积和样品浓度的线性关系良好。

图1　齐墩果酸标准曲线Fig.1　The standard curve of OA

图2　熊果酸标准曲线Fig.2　The standard curve of UA

图3　齐墩果酸标准品色谱图Fig.3　The standard of OA chromatogram

2.2OA和UA标准品与分离晶体色谱检测结果

由图3可知，齐墩果酸标准品在10.00min时有峰面积，根据标准品的保留时间确定样品中齐墩果酸的峰面积，从而计算出齐墩果酸提取率。

图4　熊果酸标准品色谱图Fig.4　The standard of UA chromatogram

由图4可知，熊果酸标准品在10.64min时有峰面积，根据标准品的保留时间确定样品中熊果酸的峰面积，从而计算出熊果酸提取率。

图5　提取方法对OA和UA总提取率的影响Fig.5　Effect of extraction methods on the total extraction rate of OA and UA

2.3单因素实验

2.3.1提取方法对OA和UA总提取率的影响如图5可知，超声波辅助提取方法对齐墩果酸和熊果酸总提取率最高，而且操作简单，所以选用超声波辅助提取。

图6　溶剂浓度对OA和UA总提取率的影响Fig.6　Effect of solvent concentration on the total extraction rate of OA and UA

2.3.2提取溶剂浓度对OA和UA总提取率的影响如图6可知，随着乙醇浓度的增加，齐墩果酸和熊果酸总提取率随之增加，95%达到最大。99%甲醇的提取率比95%乙醇总提取率稍高，但是由于甲醇对人体具有毒性，所以95%乙醇为最佳提取溶剂。

2.3.3料液比对OA和UA总提取率的影响如图7可知，随着料液比的增加，齐墩果酸和熊果酸的总提取率也随着增加。当料液比为1∶5时，齐墩果酸和熊果酸的总提取率为1.506%；当料液比为1∶10时，齐墩果酸和熊果酸的总提取率为1.592%；当料液比大于1∶10时，齐墩果酸和熊果酸总提取率反而下降，这可能是因为在提取的过程中，木瓜皮渣的质量固定，随着溶剂的增加，超声波的穿透能力下降，故而齐墩果酸和熊果酸总提取率反而下降，选取料液比为1∶10。

2.3.4提取时间对OA和UA总提取率的影响如图8可知，随着提取时间的增加，齐墩果酸和熊果酸的总提取率也随着增加。50min时，齐墩果酸和熊果酸总提取率为1.448%；超声提取60min时，齐墩果酸和熊果酸总提取率为1.453%，增长缓慢；超声提取70min时，总提取率不增长；当时间为80min时，齐墩果酸和熊果酸总提取率为1.441%，反而下降，这可能是由于齐墩果酸和熊果酸提取时间过长，一些糖类和蛋白质等杂质慢慢溶出，使得溶液粘度增大，齐墩果酸和熊果酸被吸附在固体基质上而不易被提取出来。综合考虑产品的收益与效率，选择超声提取50min最佳。

图7　料液比对OA和UA总提取率的影响Fig.7　Effect of solid-liquid ratio on the total extraction rate of OA and UA

图8　提取时间对OA和UA总提取率的影响Fig.8　Effect of extraction time on the total extraction rate of OA and UA

图9　提取温度对OA和UA总提取率的影响Fig.9　Effect of temperature on the total extraction rate of OA and UA

2.3.5提取温度对OA和UA总提取率的影响如图9可知，随着温度的升高，齐墩果酸和熊果酸总提取率也在不断的升高。当温度达到60℃时，齐墩果酸和熊果酸总提取率为0.851%；温度为70℃时总提取率为0.852%，增长缓慢；80℃时总提取率反而下降，这可能是由于长时间的高温加热使部分齐墩果酸和熊果酸发生氧化或分解反应。所以超声提取水浴的最佳温度为60℃。

2.4正交实验

由实验结果可以看出，乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度都不同程度地影响着皱皮木瓜皮渣中齐墩果酸和熊果酸总提取率。因此，正交实验以乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度4种因素，采用L9（34）正交设计，通过正交实验优化提取工艺。正交实验结果与极差分析见表2。

表2　齐墩果酸和熊果酸总提取率的正交实验结果与分析Table 2　Results and analysis of orthogonal test for the total rate of OA and UA

由正交实验结果、极差分析可以看出：各因素对齐墩果酸和熊果酸总提取率的影响程度由高到低依次为C＞A＞B＞D，即提取时间＞乙醇浓度＞料液比＞提取温度，所以提取时间对总提取率的影响最大。料液比与溶剂浓度对其总提取率亦有显著影响，提取温度影响显著性最低。综合考虑成本与效率，最佳配比为A3B3C3D3（即乙醇浓度95%，料液比1∶15，提取时间50min，提取温度70℃）。在此工艺条件下皱皮木瓜齐墩果酸和熊果酸总提取率达1.607%。

表3为齐墩果酸和熊果酸总提取率方差分析，结果表明：A、B、C对齐墩果酸和熊果酸总提取率的影响显著，并且各因素对齐墩果酸和熊果酸总提取率的影响不是简单的线性关系。由各因素的影响程度分析，各因素的F值可以反映出各因素对实验指标的重要性。F值越大，表明对实验指标的影响越大，即重要性越大。由表3可知，FA=157.000，FB=133.000，FC= 168.400，FD=1.000，即各因素对齐墩果酸和熊果酸总提取率的影响为提取时间＞乙醇浓度＞料液比＞提取温度。

3　结论

通过单因素结合正交实验优化了皱皮木瓜中齐墩果酸和熊果酸的提取工艺。确定最佳提取工艺条件为95%乙醇，料液比1∶15，提取时间50min，提取温度70℃。在此工艺条件下，齐墩果酸和熊果酸总提取率达1.607%。

表3　齐墩果酸和熊果酸总提取率的方差分析Table 3　Analysis of variance for the total rate of OA and UA

［1］郭学敏，章玲，全山从，等.皱皮木瓜中三萜化合物的分离鉴定［J］.中国中药杂志，1998，23（9）：547-576.

［2］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海：上海人民出版社，1997：3492.

［3］罗景方.木瓜中齐墩果酸分离和鉴定［J］.中草药，1983，14（11）：48.

［4］李慧芸.超声波辅助提取光皮木瓜渣中熊果酸的工艺研究［J］.陕西农业科学，2013（2）：21-23.

［5］谭仁祥.植物成分分析［M］.北京：科学出版社，2004.

［6］Liu J.Phamachology of oleanolic acid and Ursolic Acid［J］. Journal of Ethnopharmacholohy，1995（49）：57-68.

［7］Yong-Ming Zhu.Synthesis and Anti-HIV Activity of Oleanolic Acid Derivatives［J］.Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，2001（11）：3115-3118.

［8］孙涛，范杰平，胡小芳.响应面法优化超声辅助车前草中的熊果酸［J］.食品科学，2011，32（6）：80-84.

［9］马雄，陶亮亮，刘柯桐，等.响应面法优化超声提取枇杷叶中熊果酸的工艺研究［J］.饮料工业，2011，11（6）：30-35.

［10］王志芳，汪芳安，彭光华，等.木瓜中齐墩果酸和熊果酸提取工艺的优化［J］.食品科技，2006，134-137.

［11］LIU Long-xiao，WANG Xiao-cui.Olubility of oleanolic acid in various solvents from（288.3 to 328.3）K［J］.J Chem Eng，2007，52（6）：2527-2528.

Study on the conditions of extracting oleanolic acid and ursolic acid from residue of Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai

CAI Juan，LIU Shi-yao，WEI Zheng-xin，ZHANG Dan，PAN Xue-zhen，BIAN Jing-jun，BAI Zhi-chuan*
（College of Horticulture and Landscape Agriculture，Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions，Ministry of Education，Southwest University，Chongqing 400715，China）

To optimize the extracting technology for oleanolic acid and ursolic acid from residue of Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai.The orthogonal test was based on single factor and used to optimize oleanolic acid and ursolic acid with detecting the targeted component index by high performance liquid chromatography（HPLC）.It showed that the best extraction conditions were as follows：the solvent concentration 95%ethanol，the ratio of materials to solution 1∶15（g∶mL），the extracting time 50min，the extracting temperature 70℃，and the yield was 1.607%.The method of extracting by the experiment was stable and reliable，and easy to operate，and the result could provide reference data for industrial production of extracting OA and UA from Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai.

HPLC；oleanolic acid；ursolic acid；Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai

TS255.1

B

1002-0306（2015）02-0282-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.052

2014－04－14

蔡娟（1989-），女，硕士研究生，研究方向：经济植物生物技术。

白志川（1956-），女，硕士研究生，教授，研究方向：中草药药用植物研究、经济植物生物技术。

重庆科技攻关计划项目（CSTC，2009AC1180）。