响应面设计优化川明参蛋白提取工艺

董红敏，牛小勇，沈丽雯，李　路，秦　文，*（.四川农业大学食品学院，四川雅安6504；.四川南充阆中县供销合作社，四川南充637400）

响应面设计优化川明参蛋白提取工艺

董红敏1，牛小勇2，沈丽雯1，李路1，秦文1，*
（1.四川农业大学食品学院，四川雅安625014；2.四川南充阆中县供销合作社，四川南充637400）

以川明参乙醇提取后的残渣为原料，通过单因素和响应面实验对超声波辅助提取川明参蛋白工艺条件进行优化。结果表明，各因子对川明参蛋白提取率影响的先后次序为：超声功率＞液料比＞超声温度＞超声时间，最佳提取工艺条件为：pH12.5的碱溶液、液料比24∶1mL/g、超声功率185W、超声温度34℃、超声时间31min。该工艺条件下，川明参蛋白的平均提取率为54.62%。所得川明参蛋白提取回归模型高度显著（R2＝0.9484），拟合性好，可用于预测川明参蛋白提取率。

川明参，超声提取，蛋白质，响应面优化

川明参又名明参、明沙参、土明参，是伞形科（Umbelliferae）植物川明参属 “Chuanminshen violaceum Sheh et Shan”的干燥根，是我国特有的单种属植物，是四川产道地药材。具有滋阴补肺，健脾等功效，主治热病伤阴，肺热咳嗽，脾虚食少，病后体弱［1-2］。川明参主要含有多糖、蛋白质、香豆素、黄酮、甾醇、有机酸、酚类等化学成分［3］。目前国内外对川明参有效成分的提取主要集中在对原料中多糖、乙醇提取物及不同萃取物的研究［4-8］，其中几乎全部的蛋白质随废渣一起被排放掉，造成了对蛋白资源的浪费。而研究表明川明参中粗蛋白含量高达5%以上，其水解氨基酸总含量超过3%，各类氨基酸达13种以上，尤其是人体必需的7种氨基酸，占总氨基酸含量的40%以上，它们可能是川明参的主要功能成分之一，可广泛应用于医药和保健食品领域，市场前景广阔。因此高效提取川明参蛋白对其功能研究及进一步开发利用具有重要意义［9-10］。

目前，对川明参蛋白的提取工艺及其优化尚未见报道，本实验以95%乙醇提取川明参有效成分后残渣为原料，采用超声波辅助碱溶酸沉法，通过单因素实验和响应面设计，探讨残渣中蛋白质最佳超声提取工艺，为川明参蛋白的提取及综合开发利用提供指导。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

新鲜川明参2013年春由四川阆中供销社提供；川明参渣95%乙醇超声提取川明参干燥粉后的残渣；十二烷基硫酸钠（SDS） 生化试剂，Amresco进口分装；二流苏糖醇（DTT） 生化试剂，Amresco进口分装；牛血清蛋白北京拜尔迪生物有限公司；考马斯亮蓝G250上海宝曼生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

FW177中药粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司；KQ5200DB型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；UV-3200紫外可见分光光度计上海美普达仪器有限公司；Sorval ST 16高速冷冻离心机美国Thermo Scientific公司；Heto Power Dry PL3000冻干机美国Thermo Scientific公司；101-4型恒温鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司；电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.2实验方法

1.2.1川明参蛋白提取工艺流程参考文献［11-12］的方法。

1.2.2川明参总蛋白含量的测定采用微量凯氏定氮法（食品安全国家标准食品中蛋白质的测定，GB5009.5-2010）［13］测定川明参总蛋白的含量。

1.2.3川明参可溶性蛋白含量的测定以牛血清蛋白为标准品，采用考马斯亮蓝法［14-15］测定可溶性蛋白质含量。以牛血清蛋白浓度（μg/mL）为横坐标（x），吸光度A为纵坐标（y）绘制浓度-吸光度标准曲线。按1.2.1工艺流程制得的提取液稀释至一定体积，取稀释液1.0mL，加5.0mL考马斯亮蓝G-250溶液，振荡摇匀，在595nm处，以提取剂为对照，测定吸光值，通过标准曲线获得样品蛋白质浓度，并计算出在该条件下的蛋白提取率。利用式（1）计算可溶性蛋白提取率：

1.2.4提取剂的选择在超声功率80W，超声温度30℃、超声时间20min、液料比（mL/g）10∶1提取条件下，以A盐溶液（0.5mol/L NaCl），B酸溶液（蒸馏水以HCl调pH至2.0），C碱溶液（蒸馏水以NaOH调pH至12.0），D 2%SDS溶液，E裂解液（2%SDS溶液+0.2% DTT），F 0.2mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）6种提取剂提取川明参蛋白质，测定其提取率［16］。

1.2.5单因素实验

1.2.5.1pH对提取率的影响准确称取5g川明参粉，分别加入pH9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13碱溶液进行提取，每个水平重复3次。固定超声功率80W、超声温度30℃、超声时间20min、液料比10∶1，按1.2.1项操作进行提取，测定不同pH提取液中蛋白提取率。以选出的碱液pH进行超声辅助提取条件的筛选和响应面实验。

1.2.5.2超声功率对提取率的影响固定超声温度30℃、超声时间20min、液料比（mL/g）10∶1，其他条件采用以上选出的结果，超声功率设置为80、100、120、140、160、180、200W 7个水平，每个水平重复3次，测提取液中蛋白含量，考察不同超声功率对川明参蛋白提取率的影响。

1.2.5.3超声温度对提取率的影响固定超声时间20min，液料比10∶1（mL/g），超声辅助提取温度设置为30、35、40、45、50、55℃6个水平，每个水平重复3次，测提取液中蛋白含量，考察不同超声温度对川明参蛋白提取率的影响。

1.2.5.4超声时间对提取率的影响固定液料比10∶1（mL/g），其他条件采用以上选出的结果，超声辅助提取时间设置为10、20、30、40、50、60min 6个水平，每个水平重复3次，测提取液中蛋白含量，考察不同超声时间对川明参蛋白提取率的影响。

1.2.5.5液料比对提取率的影响以上述选出的结果为固定条件，设置液料比（mL/g）10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 5个水平，每个水平重复3次，测提取液中蛋白含量，考察不同液料比对川明参蛋白提取率的影响。

1.2.6响应面实验设计在单因素实验基础上，按照Box-Behnken设计原理，选择液料比、超声功率、超声温度和超声时间为自变量，以蛋白质提取率为响应值，利用Design-Expert 8.0.5b软件进行响应曲面分析优化提取条件［17-18］，响应面因素与水平表见表1。

表1　响应面分析因素与水平表Table 1　Factors and levels of response surface analysis

1.2.7川明参等电点的测定称取10g川明参粉在最佳提取条件下制备川明参蛋白溶液，离心（8000r/min、20min）得上清液，分别取上清液6份各10mL，加盐酸调pH1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，静置30min，离心（8000r/min、20min），测定上清液中蛋白质的含量，利用式（2）计算川明参蛋白的沉淀率：

绘制沉淀率与pH的曲线图，沉淀率最大时的pH即为川明参蛋白的等电点［17］。

2　结果与分析

2.1川明参总蛋白含量

采用微量凯氏定氮法（食品安全国家标准食品中蛋白质的测定，GB5009.5-2010）测定川明参总蛋白的含量为4.24%。

2.2标准曲线的绘制

以牛血清蛋白浓度（μg/mL）为横坐标（x），吸光度A为纵坐标（y）绘制浓度-吸光度标准曲线（图1）。得到标准曲线方程：y=0.0054x+0.0075，R2=0.9990。结果表明，牛血清白蛋白标准溶液的质量浓度在0～100μg/mL范围内与吸光度具有良好的线性关系。

2.3提取剂对提取率的影响

以6种提取剂提取川明参蛋白，提取率的结果如图2所示。由图2可见，以C，即碱溶液（蒸馏水以NaOH调pH至12.0）为提取剂时，川明参蛋白质提取率最高，为18.62%。其次为E裂解液，提取率最低的为B酸溶液，仅为1.93%。因此，后续实验以碱溶液为提取剂进一步优化提取条件。

图1　川明参蛋白质含量测定的标准曲线Fig.1　Standard curve on protein content determination

图2　不同提取剂对川明参蛋白提取率的影响Fig.2　Effect of different extracts on the extraction yield of protein from chuanminshen violaceum

2.4单因素实验

2.4.1pH对川明参蛋白提取率的影响不同pH对川明参蛋白提取率的影响结果如图3所示，川明参蛋白的提取率随pH的增大而增加，pH大于11后提取率增长迅速，pH12.5时提取率最大，之后提取率变化不大。因此，后续实验选择pH为12.5进一步优化提取条件。

图3　pH对川明参蛋白提取率的影响Fig.3　Effect of pH on the extraction yield of protein from chuanminshen violaceum

2.4.2超声功率对川明参蛋白提取率的影响不同超声功率对川明参蛋白提取率的影响结果如图4所示，随着超声功率的增加，川明参蛋白的提取率逐渐增加，功率达到180W时，提取率最大，随后提取率开始下降。可能是因为超声功率增大，空化作用加强，超声波对细胞壁的破碎作用增强，蛋白溶出速率加快，提取率升高；但功率过大，空化作用及其伴随的机械效应也会破坏蛋白质的结构，影响蛋白质的提取率［19］。因此超声功率以180W为宜。

图4　超声功率对川明参蛋白提取率的影响Fig.4　Effect of ultrasonic power on the extraction yield of protein from chuanminshen violaceum

2.4.3超声温度对川明参蛋白提取率的影响不同超声温度对川明参蛋白提取率的影响结果如图5所示，温度在30～35℃之间时，川明参蛋白提取率随温度升高而升高，随后提取率逐渐下降。可能是因为低温时，超声波未能使细胞彻底破碎，随着温度的升高，超声波与温度的协同作用进一步破坏了细胞结构，从而使蛋白充分释放；但温度过高，这种协调作用也会引起蛋白质的变性［20］。综合各因素，选择35℃为川明参蛋白最佳超声提取温度。

图5　超声温度对川明参蛋白提取率的影响Fig.5　Effect of extraction temperature on the extraction yield of protein from chuanminshen violaceum

2.4.4超声时间对川明参蛋白提取率的影响不同超声时间对川明参蛋白提取率的影响结果如图6所示，在10～30min时，蛋白的提取率随着超声时间的增加而明显提高，随后提取率呈下降趋势。其原因可能是随着时间的增加，在超声波作用下川明参细胞破碎度逐渐增大，蛋白溶出量逐渐增加，提取率提高；但超声波作用时间过长会影响蛋白质的活性，提取时间超过30min后，超声波对蛋白质的破坏程度加大，影响提取率［21］。因此超声波作用时间以30min为宜。

2.4.5液料比对川明参蛋白提取率的影响不同液料比对川明参蛋白提取率的影响结果如图7所示，液料比在10∶1～25∶1之间时，川明参蛋白提取率随提取剂用量的增加明显升高，当液料比25∶1时，提取率达到最大值，随后蛋白的提取率有所下降，原因可能是随着液料比的增加，增加了固相与液相间蛋白的浓度差，有利于蛋白质的充分溶出［22］；液料比达到一定程度后，在超声波功率恒定的情况下，液料比增加会使超声波空化作用相对降低，而使提取率下降。故选较优液料比为25∶1。

图6　超声时间对川明参蛋白提取率的影响Fig.6　Effect of ultrasonic action time on the extraction yield of protein from chuanminshen violaceum

图7　液料比对川明参蛋白提取率的影响Fig.7　Effect of liquid to solid ratio ratio on the extraction yield of protein from chuanminshen violaceum

2.5响应面法优化超声辅助提取条件

2.5.1实验设计与结果在单因素实验的基础上，以提取率为实验指标，用Design-Expert 8.0.5b软件设计响应面实验方案，对超声波辅助提取条件进行优化，选择液料比（X1），超声功率（X2），超声温度（X3）与超声时间（X4）作为响应面实验的因素，以4因素3水平正交二次旋转组合设计进行实验，响应面实验设计及结果见表2。

表2　响应面实验设计及结果Table 2　Experimental design and results of response surface analysis

2.5.2回归方程的建立与检验运用Design Expert 8.0.5b数据统计分析软件对表2实验结果进行多元回归拟合，回归模型方差分析见表3，回归系数显著性检验见表4。得超声辅助提取川明参蛋白提取率对液料比（X1），超声功率（X2），超声温度（X3）与超声时间（X4）的二次多项式回归模型为：

表3　回归模型方差分析Table 3　Analysis of variance for the fitted regression model

从表3可以看出，该模型p＜0.0001，表明该二次回归方程模型极显著，模型的相关系数R2=0.9484，校正决定系数R2Adj=0.8967，表明模型实际值与预测值拟合较好，失拟项p=0.8820＞0.05，失拟项不显著，实验误差较小，因此可用该模型对川明参蛋白超声提取实验进行分析和预测。

由表4可知，模型一次项X1、X2，模型交互项X2X3，模型二次项差异极显著；模型一次项X3，模型交互项X1X2、X1X3、X2X4差异显著，说明实验因素对响应值提取率的影响不是简单的线性关系。各因素对川明参蛋白提取率大小的影响依次是超声功率（X2）＞液料比（X1）＞超声温度（X3）＞超声时间（X4）。

表4　回归系数的显著性检验Table 4　Significance test of each regression coefficient

2.5.3响应面和等高线分析由表4可知，液料比和超声功率，液料比和超声温度，超声功率和超声温度，超声功率和超声时间的交互作用对川明参蛋白提取率影响显著。

图8　各两因素交互作用的响应面及等高线图Fig.8　Response surface and contour of the effects of any two factors on the yield of chuanminshen violaceum protein

由图8（a）可以看出，当超声时间和超声温度固定零水平时，液料比和超声功率的交互作用对蛋白提取率有显著的影响。当液料比固定不变时，随着超声功率的增加蛋白提取率呈现出先增后减的趋势；当超声功率固定不变时，随着液料比的增加蛋白提取率呈现出先增后减的趋势。

从图8（b）可以看出，当超声功率和超声时间固定零水平时，液料比和超声温度的交互作用对蛋白提取率有显著的影响。当液料比固定不变时，随着超声温度的增加蛋白提取率呈现出先增后减的趋势；当超声温度固定不变时，随着液料比的增加蛋白提取率呈现出先增后减的趋势。

图8（c）中显示，当料液比和超声时间固定零水平时，川明参蛋白提取率受超声功率和超声温度交互作用影响极显著。当超声功率固定不变时，随着超声温度的增加蛋白提取率呈现出先增后减的趋势；当超声温度固定不变时，随着超声功率的增加蛋白提取率呈现出先增后减的趋势。

由图8（d）可以看出，当液料比和超声温度固定零水平时，超声功率和超声时间对川明参蛋白提取率的交互作用显著。当超声功率固定不变时，随着超声时间的增加蛋白提取率呈现出先增后减的趋势；当超声时间固定不变时，随着超声功率的增加蛋白提取率呈现出先增后减的趋势。

2.6验证实验

通过所得回归模型对提取工艺进行优化获得的最佳超声提取工艺条件组合为：液料比23.63∶1、超声功率185W、超声温度34.19℃、超声时间30.92min，在此超声条件下，预测川明参蛋白提取率可达到52.95%。考虑到实际操作的可行性，将川明参蛋白超声提取工艺条件修正为：液料比24∶1、超声功率185W、超声温度34℃、超声时间31min。采用上述优化条件进行3次验证实验，川明参蛋白提取率实测值平均为54.62%，与预测值的相对误差为1.67%，由此可见，采用响应面分析法对川明参蛋白超声提取工艺的优化是行之有效的。

2.7酸沉淀川明参蛋白

由图9可知，川明参蛋白的沉淀率随着pH的升高呈先上升后下降的趋势，在pH2.0时沉淀率最大，即川明参蛋白质的等电点为2.0。在等电点沉淀蛋白，离心去上清液，沉淀即为川明参蛋白。

图9　川明参蛋白等电点Fig.9　Isoelectric point of protein from chuanminshen violaceum

3　结论

通过单因素实验及响应面法优化实验，选出川明参蛋白最佳提取剂为碱溶液，固定pH为12.5，得出超声波辅助提取川明参蛋白的最佳优化工艺条件为：液料比24∶1、超声功率185W、超声温度34℃、超声时间31min，在此工艺条件下川明参蛋白质提取率为54.62%。通过酸沉法测定沉淀率得出川明参蛋白等电点为2.0，将川明参蛋白超声提取液调pH至等电点，对川明参蛋白进行酸沉淀，可将川明参蛋白从提取液中分离出来。本研究采用超声波和碱溶酸沉共同作用的方法大大提高了川明参蛋白提取率，且提取时间短，温度低，操作简单，降低了生产成本。

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Optimization of protein extraction from Chuanminshen violaceum based on response surface methodology

DONG Hong-min1，NIU Xiao-yong2，SHEN Li-wen1，LI Lu1，QIN Wen1，*
（1.College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.Langzhong Supply and Marketing Cooperative of Sichuan Nanchong，Nanchong 637400，China）

The extraction condition of protein from Chuanminshen violaceum by ultrasonic extraction was optimized by single factor experiments and response surface methodology.The results showed that all investigated parameters had a notable effect on the extraction yield of protein and could be ranked in decreasing order of importance in their effects as follows：extraction temperature，solid-liquid ratio，ultrasonic action time and ultrasonic power.The optimum conditions for extracting protein from Chuanminshen violaceum were determined as follows：pH12.5，liquid-solid ratio（mL/g）24∶1，ultrasonic power 185W，extraction temperature 34℃，ultrasonic action time 31min.Under this condition，the average rate of extraction of polysaccharides was 54.62%.The established regression model describing the extraction yield of protein as a function of four extraction parameters was highly significant（R2=0.9484）.The predictive and experimental results were found to be in good agreement.Thus，the model was applicable for the prediction of protein yield.

Chuanminshen violaceum；ultrasonic extraction；protein；response surface optimization

TS201.1

B

1002-0306（2015）02-0276-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.051

2014－05－09

董红敏（1989-），女，硕士研究生，研究方向：农产品产后处理与品质控制。

秦文（1967-），女，博士研究生，教授，研究方向：农产品产后处理与品质控制。