黑米花色苷的分离纯化及其抗氧化性的研究

王巧娥，谢　丹，钱　洁，任海毅，董银卯（.北京工商大学理学院/北京市植物资源研究开发重点实验室，北京00048；.天津科技大学材料科学与化学工程学院，天津300457）

黑米花色苷的分离纯化及其抗氧化性的研究

王巧娥1，谢丹1，钱洁2，任海毅1，董银卯1
（1.北京工商大学理学院/北京市植物资源研究开发重点实验室，北京100048；2.天津科技大学材料科学与化学工程学院，天津300457）

对黑米花色苷进行分离纯化并研究不同部分的抗氧化活性。首先采用溶剂萃取的方法将黑米花色苷粗提取物依极性大小分成石油醚可溶部位、乙酸乙酯可溶部位、正丁醇可溶部位和水可溶部位，并对各部位清除2，2-二苯基-1-苦味肼基自由基（DPPH·）和羟基自由基（·OH）的活性进行了分析，确定了抗氧化能力最强的组分是水可溶部分。其次用大孔树脂柱层析的方法对水可溶部位进行了细分，得到C1、C2、C3、C4、C5五个组分，并对各组分清除DPPH·和·OH的活性进行了分析，确定了各组分抗氧化能力从大到小依次为：C2＞C3＞C4＞C1＞C5。研究发现，黑米花色苷水可溶部位中20%～40%乙醇洗脱的部分（C2、C3）具有更强的抗氧化活性。

花色苷，黑米，溶剂萃取，柱层析，抗氧化

近年来，活性氧和自由基的研究成为现代生命科学的前沿和热点［1］，作为天然的抗氧化剂，花色苷类化合物被广泛应用在医药［2-4］、食品、化妆品、电化学等很多领域［5-6］。黑米花色苷属黄酮多酚类物质，是由花青素与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等通过糖苷键结合形成的糖苷，主要包括锦葵素、天竺葵-3，5-二葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3，5-二葡萄糖苷（其结构见图1），一般是几种花色苷并存［7］。研究表明，黑米花色苷具有很强的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗过敏、降血脂等多种功能，而且其生物活性因其B环的化学结构不同而存在一定的差异［8］，这就需要对黑米中花色苷的单体组成进行明确并深入研究其抗氧化活性等生理功能。

目前，有关黑米花色苷的研究多集中于黑米花色苷的提取方法。Toshio K等［9］用纯水提取黑米花色苷，建立了用提取液在可见光区的最大吸收强度检测提取液黑米花色苷浓度的新方法；发现黑米花色苷的提取率与提取温度呈正线性相关。陈小全等［10］采用有机溶剂浸泡法和超声波辅助技术从黑米中提取色素，比较发现超声波作用下能够缩短提取时间，降低提取温度。张吉祥等［11］采用正交实验法，研究超声波功率、浸提时间、浸提剂体积分数及料液比对黑米色素提取率的影响，优化了黑米花色苷的最佳超声辅助提取工艺。然而目前对黑米花色苷的分离纯化方法的研究较少，对其抗氧化活性的研究也不深入。本文按照极性大小对黑米花色苷进行萃取分部，比较各部分的体外抗氧化效果，并对抗氧化活性最强的部分进一步分离纯化，比较每一组分的体外抗氧化活性，对黑米花色苷的开发和综合利用有重要的指导意义。

图1　四种黑米花色苷结构图Fig.1　The constitutional formula of anthocyanins from black rice

1　材料与方法

1.1材料与仪器

AB-8型大孔吸附树脂北京慧德易科技有限责任公司；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、维生素C、DPPH、七水合硫酸亚铁、水杨酸、双氧水、盐酸、氢氧化钠等试剂均为常用分析纯；去离子水、超纯水均为自制；黑米花色苷粗提物参考张志辉等［12］的方法，取一定量粉碎、过筛后的黑米粉于烧瓶中，以料液比1∶8加入70%乙醇溶液（pH2～3），在温度50℃、功率70W时，超声波提取30min。提取液过滤后50℃减压浓缩，冷冻干燥后冰箱保存备用。

RE-2000旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；Advantage-ES冷冻干燥机美国VIRTIS公司；BSA124S分析天平SARTORIUS公司；UV2300紫外分光光度仪上海天美科学仪器有限公司；LIH-SI-NI电热恒温水浴锅北京长安科技仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1黑米花色苷的溶剂萃取分级取一定量黑米花色苷粗提物，用200mL水溶解后置于500mL分液漏斗中，加入200mL石油醚萃取3次脱脂［7］。

脱脂后的花色苷（水相）置于500mL分液漏斗中，加入200mL乙酸乙酯，振摇，静置，待溶液完全分层后，分相。用同法再萃取2次，收集并合并3次乙酸乙酯相，35℃减压浓缩，冷冻干燥，得到紫色粉末，为黑米花色苷乙酸乙酯可溶部位。

乙酸乙酯萃取剩余后的水溶液，按上述同样的方法用正丁醇萃取3次，将上层的正丁醇萃取液合并，减压浓缩，冷冻干燥，得到深紫色粉末，为黑米花色苷正丁醇部位。正丁醇萃取后的剩余水溶液，减压浓缩，冷冻干燥，得到深紫色粉末，为黑米花色苷水可溶部位。

1.2.2主活性部分的大孔树脂柱层析分离［13-14］

1.2.2.1装柱与预处理取柱体积为250mL的大孔树脂于事先装有去离子水的敞口容器中，使去离子水高于树脂层2～3cm，浸泡过夜，待树脂充分溶胀后湿法装柱。装好的大孔树脂柱首先用2BV 95%乙醇以2BV/h的流速通过树脂层，浸泡过夜，第2d用95%乙醇以2BV/h的流速通过树脂层，洗至流出液加水不呈白色浑浊，用去离子水以2BV/h的流速洗净乙醇；其次用2BV 4%盐酸溶液以5BV/h的流速通过树脂层，浸泡3h后用去离子水洗至出水pH中性；再次用2.5BV 5%NaOH溶液以5BV/h的流速通过树脂层，浸泡3h后用去离子水洗至出水pH为中性。

1.2.2.2上样采用干法上样。将黑米花色苷水可溶部位粉末用少量去离子水溶解后加入少量大孔树脂，拌匀，静置，将带有样品的大孔树脂加到柱子顶层。

1.2.2.3洗脱依次用2～3BV去离子水、20%乙醇溶液、40%乙醇溶液、60%乙醇溶液、80%乙醇溶液以2BV/H的流速洗脱，收集洗脱液。

1.2.2.4洗脱液的处理5种洗脱液用旋转蒸发仪减压浓缩，浓缩液冷冻干燥，得到水可溶部位5种洗脱液的花色苷固体粉末，依次标记为C1、C2、C3、C4、C5，密闭保存，备用。

1.2.3抗氧化能力的测定

1.2.3.1DPPH法测定不同极性部位和水可溶部位不同组分的抗氧化能力将黑米花色苷乙酸乙酯、正丁醇和水可溶部位以及水可溶部位大孔树脂分离后得到的C1～C55个组分分别配成适当浓度梯度的溶液，在517nm下检测其清除DPPH·的能力，绘制DPPH·清除率对抗氧化剂浓度曲线，并计算出IC50的值，比较不同部位和组分的抗氧化能力，确定清除DPPH·能力最强的部位。用维生素C作为阳性对照，具体实验方法见文献［15-16］。

1.2.3.2·OH法测定不同极性部位的抗氧化能力将黑米花色苷乙酸乙酯、正丁醇和水可溶部位以及水可溶部位大孔树脂分离后得到的C1～C55个组分分别配成相同浓度梯度的溶液，依次加入所需试剂，在510nm下检测其清除羟基自由基（·OH）的能力，绘制·OH清除率对抗氧化剂浓度曲线，比较不同部位和组分的抗氧化能力。用维生素C作为阳性对照，具体实验方法见文献［17-18］。

2　结果与讨论

2.1不同极性部位的抗氧化能力

体外的抗氧化活性研究［1］表明，黑米花色苷不同极性部位均具有一定的还原能力和抗氧化能力。本文通过评价其对DPPH·和·OH的清除能力，探讨黑米花色苷不同极性部位的抗氧化活性。

2.1.1不同极性部位清除DPPH·的能力抗氧化剂对DPPH·自由基的淬灭能力可有效地评价其抗氧化活性，在国内外被广泛用于天然抗氧化剂的筛选［9］。通过清除DPPH·能力评价抗氧化活性的方法简便、快速，同时DPPH·较长的半衰期使此方法保持了良好的重现性。本文即通过测试黑米花色苷不同极性部位对DPPH·的清除能力来评价其抗氧化能力［17］，并采用DPPH·清除率为50%时所需抗氧化剂的浓度，即IC50值表示待测组分对DPPH·的清除能力。通常IC50值越小，表明该物质清除自由基的能力越强。

将冷冻干燥后的黑米花色苷乙酸乙酯、正丁醇和水可溶部位配成相同浓度梯度的溶液，以浓度（mg/mL）作为横坐标，DPPH·清除率（%）作为纵坐标，绘制待测样品DPPH·清除率对其浓度曲线（见图2），其中维生素C为阳性对照。根据图2，计算得出其IC50值，见图3。

图2　维生素C和黑米花色苷不同溶剂可溶部位清除DPPH·曲线Fig.2　The DPPH free radical scavenging lines of vitamin C and different solvent soluble fractions of anthocyanins from black rice

图3　黑米花色苷不同溶剂可溶部位清除DPPH·自由基的IC50值Fig.3　The DPPH free radical scavenging IC50value of the different polar solvent soluble fractions

图2和图3的结果表明：黑米花色苷乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位均有一定的DPPH·清除能力，且其清除能力的大小均与其浓度呈正线性相关；由图3可知，3个不同极性部位的IC50值有显著性差异（p＜0.05），水可溶部位显著优于正丁醇部位和乙酸乙酯部位，黑米花色苷不同极性部位对DPPH·清除能力的大小关系为：水部位＞正丁醇部位＞乙酸乙酯部位。表明黑米花色苷中极性越大的组分，其清除DPPH·的能力越强。

2.1.2不同极性部位清除·OH的能力抗氧化剂对·OH自由基的淬灭能力可有效地评价其抗氧化活性。本文通过测试黑米花色苷不同极性部位对·OH自由基的清除能力来评价其抗氧化能力。以各部位浓度（mg/mL）作为横坐标，·OH自由基清除率（%）作为纵坐标，绘制待测样品·OH清除率对其浓度曲线见图4。

图4　黑米花色苷各极性部位清除·OH曲线Fig.4　The Hydroxyl radical scavenging lines of the different polar solvent soluble fractions

图4的结果表明：黑米花色苷乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位均有清除羟自由基的活性，且各极性部位对·OH的清除能力随着浓度升高而升高；就各极性部位清除·OH的能力而言，水可溶部位略优于正丁醇部位，乙酸乙酯部位最差，表明黑米花色苷中极性越大的组分，其清除·OH的能力越强。这与清除DPPH·的结果一致。

综合各部位清除DPPH·和·OH的能力，可以得出结论：不同极性黑米花色苷的抗氧化活性不同，极性越大，抗氧化能力越强；黑米花色苷不同极性部位的抗氧化活性在一定浓度范围内均具有剂量—效应关系。

2.2水可溶部位各组分的抗氧化能力

2.2.1水可溶部位各组分清除DPPH·的能力将经过大孔树脂分离得到的C1、C2、C3、C4、C5五个组分均配制成浓度为0.04、0.05、0.0667、0.1、0.2mg/mL水溶液，以各组分浓度（mg/mL）为横坐标，DPPH·清除率（%）作为纵坐标，绘制待测样品DPPH·清除率对其浓度曲线（见图5）。根据图5，计算得出其IC50值，见图6。

图5　黑米花色苷水可溶部位各组分清除DPPH·曲线Fig.5　The DPPH free radical scavenging lines of the parts of the black rice anthocyanin water soluble fractions

图6　黑米花色苷水可溶部位不同组分清除DPPH·自由基的IC50值Fig.6　The DPPH free radical scavenging IC50value of the parts of the black rice anthocyanin water soluble fractions

图5、图6表明，黑米花色苷水可溶部位经大孔树脂分离得到的C1、C2、C3、C4、C5五种组分均具有DPPH自由基清除活性，且其清除率均和样品浓度成正线性相关；C2（20%乙醇洗脱的组分）、C3（40%乙醇洗脱的组分）的抗氧化能力高于黑米花色苷水可溶部位的抗氧化能力，而C1（水洗脱的组分）、C4（60%乙醇洗脱的组分）、C5（80%乙醇洗脱的组分）的抗氧化能力则低于黑米花色苷水可溶部位的抗氧化能力，这说明20%～40%乙醇洗脱的组分抗氧化能力最强。

2.2.2水可溶部位各组分清除·OH的能力将经过大孔树脂分离得到C1、C2、C3、C4、C5均配制成0.2、0.25、0.333、0.5、1.0mg/mL水溶液，与FeSO4溶液和H2O2反应生成的·OH反应，计算不同浓度下各溶液对·OH的清除率。以溶液浓度（mg/mL）为横坐标，清除率（%）为纵坐标，绘制C1、C2、C3、C4、C55个组分对·OH的清除率对其浓度曲线见图7。

图7　黑米花色苷水可溶部位AB-8树脂分离后各组分清除·OH曲线Fig.7　The Hydroxyl radical scavenging lines of the parts of the black rice anthocyanin water soluble fractions

图7的结果表明：黑米花色苷水可溶部位经过AB-8大孔树脂分离后得到的5个组分均有清除羟自由基的活性，且组分对·OH自由基的清除能力随着浓度升高而升高；就各组分清除·OH自由基的能力而言，从大到小依次为C2＞C3＞C4＞C1＞C5，且其中C2（20%乙醇洗脱的组分）、C3（40%乙醇洗脱的组分）两个组分对·OH自由基的清除能力大于分离前的水可溶部位，而C1（水洗脱的组分）、C4（60%乙醇洗脱的组分）、C5（80%乙醇洗脱的组分）三个组分对·OH自由基的清除能力小于分离前的水可溶部位。这说明20%～40%乙醇洗脱的组分抗氧化能力最强，与清除DPPH·的结果一致。

综合各部位清除DPPH·和·OH的能力，可以得出结论：黑米花色苷水可溶部位经AB-8大孔树脂分离后得到的五个组分均具有一定的抗氧化活性，且其抗氧化能力在一定浓度范围内存在剂量效应关系；不同浓度乙醇洗脱得到的各组分的抗氧化活性不同，从大到小依次为C2＞C3＞水可溶部位＞C4＞C1＞C5，这说明黑米花色苷水可溶部位中20%～40%乙醇洗脱的部分（C2、C3）具有更强的抗氧化活性。

3　结论

将黑米花色苷粗提物通过溶剂萃取按极性大小分成三个部位：乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位，通过分析各部位清除DPPH·和·OH的能力，确定抗氧化活性最高的部位为水部位。

对抗氧化活性最好的水部位，采用AB-8大孔吸附树脂柱进一步分离纯化，得到C1、C2、C3、C4、C55个组分，通过分析这五种组分清除DPPH·和·OH的能力，确定黑米花色苷水可溶部位中20%～40%乙醇洗脱的组分（C2、C3）具有更强的抗氧化活性。

经AB-8型大孔吸附树脂分离后并未得到黑米花色苷单体，目前作者所在的课题组正对C2、C3进行进一步的分离纯化，希望得到具抗氧化活性的花色苷单体2～4种，从而为构效关系研究及在化妆品、食品中的高附加值应用奠定基础。

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Study on separation of anthocyanins from black rice and their antioxidation

WANG Qiao-e1，XIE Dan1，QIAN Jie2，REN Hai-yi1，DONG Yin-mao1
（1.School of Sciences，Beijing Key Lab of Plant Resource Research and Development，Beijing Technology and
Business University，Beijing 100048，China；2.Faculty of Chemistry and Materials Science，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Anthocyanins from black rice were separated and their antioxidation was evaluated.Anthocyanin crude extract of black rice was separated to petroleum ether part，ethyl acetate part，n-butyl alcohol part and water soluble part by solvent extraction method.The DPPH radical and hydroxyl radical-scavenging activities were used to determine the antioxidant capacity of each part，the water soluble part was confirmed to have the most significant antioxidation.Then it was separated to five fractions which were C1，C2，C3，C4，C5by macroporous resin column chromatography method and the DPPH radical and hydroxyl radical-scavenging activities of each fraction were analyzed.The results showed that the antioxidant capacity in a descending order as：C2，C3，C4，C1，C5.Among the water soluble part，the fraction eluted by 20%～40%ethanol solution had the highest antioxidant capacity.

anthocyanin；black rice；solvent extraction；column chromatography；antioxidaion

TS210.1

A

1002-0306（2015）02-0157-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.025

2014-04-23

王巧娥（1976-），女，博士，副教授，研究方向：天然功效成分提取、分离和活性研究。

北京市优秀人才培养资助项目（2012D005003000008）。