UPLC-MS/MS与HPLC测定茶叶中10种氨基甲酸酯类农药残留的比较

仲伶俐，胡　莉，郭灵安，雷绍荣，毛建霏，付成平（四川省农业科学院分析测试中心，四川成都610066）

UPLC-MS/MS与HPLC测定茶叶中10种氨基甲酸酯类农药残留的比较

仲伶俐，胡莉，郭灵安*，雷绍荣，毛建霏，付成平
（四川省农业科学院分析测试中心，四川成都610066）

比较了超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）与高效液相色谱（HPLC）法测定茶叶中10种氨基甲酸酯类农药残留的分析方法。样品经乙腈提取，氨基固相萃取柱净化，HPLC和UPLC-MS/MS测定。结果表明，在相同的前处理条件下，两种方法均具有较好的准确度和精密度，UPLC-MS/MS法在0.01～0.1mg/kg添加水平下回收率为75.2%～115.6%，相对标准偏差（RSD）为4.4%～16.7%。HPLC法在0.05～1.0mg/kg添加水平下回收率为82.7%～120.7%，相对标准偏差（RSD）为0.8%～12.9%。UPLC-MS/MS法相对于HPLC法有更高的灵敏度，10种氨基甲酸酯类农药在UPLC-MS/MS上检出限为0.02～0.3μg/kg，HPLC法检出限为3～7.5μg/kg；其高灵敏度和选择性，使其更适于多农药残留同时检测和微量残留检测。

超高效液相色谱-串联质谱，高效液相色谱，茶叶，氨基甲酸酯

茶叶是我国出口的主要经济作物之一。近年，茶叶中农药残留超标和使用违禁药物的现象备受关注。卫生部食品污染源调查项目中，已经要求对茶叶中氨基甲酸酯类化合物污染情况进行检测。早在2011年9月与12月，欧盟两次出台法规，强化对中国输欧茶叶的口岸抽检力度。此外，欧盟近年密集出台茶叶农残限量标准，使得输欧茶叶市场准入资格日益严苛。欧盟对农残标准的高要求，也导致了中国茶叶出口受到影响［1-2］。

氨基甲酸酯类农药是继有机氯、有机磷类农药后发展较为迅速的一类高效、广谱杀虫剂，主要应用于粮食、蔬菜和水果上，近几年在茶叶中的使用量和检出率也逐年增加［3-7］。目前，有关氨基甲酸酯类农药检测的报道涉及水果、蔬菜、小麦、烟草、水、茶叶等基质。方法主要有酶联免疫法、气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱法（HPLC-MS）等［2-5，7-15］。其中，HPLC柱后衍生荧光检测方法成熟，灵敏度高，应用较普遍。近年，LC-MS-MS分析技术以其很高的灵敏度和分离能力等优点而发展迅速，而茶叶基质复杂（含有多达数百种化学成分），其农药残留分析时杂质干扰严重。研究茶叶中农药残留已成为食品安全检测技术研究的难点和热点。

本研究对超高效液相色谱-串联质谱法和液相色谱法测定茶叶中10种氨基甲酸酯类农药残留进行了对比。旨在探寻相同的前处理条件下，两种不同的检测方法之间的差异性，以便在实际工作中合理选择适用的方法，充分发挥各自的优点，提高工作效率。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

茶叶样品峨眉山绿毛峰，四川省峨眉山市茶厂，2012年3月18日，一芽一叶，粉碎备用；10种氨基甲酸酯类农药标准物质标准溶液，浓度1000μg/mL，农业部环境质量监督检验测试中心；甲醇、乙腈色谱纯，美国SIGMA-ALDRICH；二氯甲烷色谱纯，美国Honeywell Burdick&Jackson；氯化钠分析纯，汕头市西陇化工厂有限公司；氨基固相萃取柱6mL，500mg，美国Agilent Accubond NH2；实验用水均为超纯水；柱后衍生试剂套装含OPA稀释溶液cat.No CB910、0.05mol/L NaOH溶液cat.No CB130、OPA cat. No 0120、Thiofluor cat.No 370022000，美国Pickering公司。

Waters Xevo TQ超高效液相色谱-串联质谱仪、Waters e2695高效液相色谱仪配有2487荧光检测器和柱后衍生装置，美国Waters；R-210旋转蒸发仪德国BUCHI；培英THZ-C恒温振荡器大仓市实验设备厂；DT-1002A电子天平常熟市金羊砝码仪器有限公司；微孔滤膜0.22μm，天津津腾实验设备有限公司；ACD1-2005-U实验室超纯化水机艾科浦。

1.2实验方法

本实验采用相同的样品前处理方法，进行UPLCMS/MS和HPLC两种不同方法的测定。

1.2.1标准溶液配制吸取农药标准溶液（浓度1000μg/mL）1mL于10mL刻度试管中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成100μg/mL的农药标准储备溶液。移取各农药标准储备液0.1mL于10mL刻度试管中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成1.0μg/mL的混合标准工作溶液。上机标准使用液用前根据需要用甲醇-水（1∶1）稀释成适当浓度。实验中串联质谱法均以基质标准溶液进行定量，基质标准使用液用阴性空白样品溶液稀释成适当浓度。

1.2.2样品制备和提取称取5g试样（精确至0.01g）于磨口锥形瓶中，加入20mL水，涡旋，使茶叶充分润湿，静置溶胀20min，加入50mL乙腈提取液，置于振荡器上振荡1h，过滤，滤液收集到装有约5g氯化钠（氯化钠用前于140℃烘烤4h）的50mL具塞量筒中，盖上塞子，震摇1min，静置2h。盐析分层后吸取10mL上清液（乙腈相）于100mL梨形瓶中，40℃水浴旋转蒸干，加入3.0mL淋洗液（甲醇+二氯甲烷=5+95）溶解残渣，盖上塞子待净化。

1.2.3SPE净化浓缩氨基SPE小柱用4mL淋洗液活化，弃去淋洗液，当液面快要到达SPE柱吸附层表面时，将待净化样品溶液转移至SPE小柱中，收集流出液于50mL梨形瓶中，再用淋洗液洗涤装样液的梨形瓶三次（3+2+2mL），并转至SPE小柱，合并淋洗液。淋洗液于30℃水浴旋转蒸发至近干，洗耳球吹干，用甲醇-水（1∶1）定容至2.0mL，涡旋混匀，过0.22μm滤膜，待测。添加回收实验前处理同空白样品。即将标准物质添加到样品，静置半小时后以同样的方法提取净化。

1.2.4实验条件

1.2.4.1高效液相色谱法色谱柱：waters carbamate（3.9mm×150mm，5μm）；柱温：40℃；进样量：20μL。流动相A：水，流动相B：甲醇；流速：0.8mL/min；梯度洗脱程序：0～2min，85%A；2～10min，85%～65%A；10～21min，65%～60%A；21～25min，60%～20%A；25～30min，20%～85%A；30～35min，85%A。

1.2.4.2超高效液相色谱-串联质谱法色谱柱：Thermo C18（2.1mm×50mm，1.7μm）；柱温：40℃；进样量：5μL。流动相A：水，流动相B：甲醇-乙腈=1∶1；流速：0.3mL/min；梯度洗脱程序：0～1min，80%A；1～3min，80%～50%A；3～4.2min，50%～20%A；4.2～5.2min，20% A；5.2～5.5min，20%～80%A；5.5～6.5min，80%A。离子源为电喷雾（ESI+），扫描方式为多反应监测（MRM），毛细管电压：3.5kV，离子源温度：150℃，脱溶剂气（N2）温度：350℃，脱溶剂气流速：700L/h，锥孔气流速：50L/h，碰撞气流速（Ar）：2.2L/h。其他相关质谱参数见表1。

表1　10种氨基甲酸酯农药质谱参数Table 1　UPLC-MS/MS parameters for 10 carbamate pesticides

2　结果与讨论

2.1仪器条件的优化

2.1.1色谱条件的优化HPLC法检测时对液相色谱分离要求较高，如残杀威和克百威这两个较难分离的组分，需要足够的分析时间和合适的梯度条件才能达到基线分离（图1）。而串联质谱法对色谱分离的要求则不那么严格，即使没有完全分离也不影响定量分析（图2），这也是其同时分析多组分农残的优势所在。茶叶空白样品和茶叶加标样品的总离子流色谱图见图2、图3，液相色谱图见图1、图4。

图1　HPLC测定茶叶加标（0.1mg/kg）样品色谱图Fig.1　Chromatography of tea sample spiked with a mixture of carbamate pesticide standards（0.1mg/kg）by HPLC

图2　UPLC-MS/MS测定茶叶加标样品（0.05mg/kg）总离子流色谱图Fig.2　Total ion current chromatograms（TIC）of tea sample spiked with a mixture of carbamate pesticide standards（0.05mg/kg）by UPLC-MS/MS

2.1.2质谱参数的选择氨基甲酸酯类化合物易离子化，适合采用ESI源。其含有的氨基甲酰基-OCONHCH3是一个给电子基团，容易得到一个质子，故容易在正离子模式下得到更多的离子，获得响应［17］。首先采用直接进样方式，在ESI+模式下找到母离子，然后通过调节碰撞能量选择2个相对丰度较高的特征离子作为定量离子和定性离子（见表1）。分析时再结合化合物保留时间等信息，进行定性、定量分析。从茶叶空白样品和加标样品总离子流色谱图（图2、图3）中可以看出，在串联四级杆多反应监测（MRM）模式下进行检测，所选的定量离子和定性离子具有很高的特异性，各目标物质分析时均不存在干扰。

图3　UPLC-MS/MS测定茶叶空白样品总离子流色谱图Fig.3　Total ion current chromatograms（TIC）of tea sample by UPLC-MS/MS

图4　HPLC测定茶叶空白样品液相色谱图Fig.4　Chromatography of tea sample by HPLC

2.2基质效应的影响探讨

液相色谱-串联质谱检测时普遍存在基质效应问题，当样品中的共提取物与被测物一同进入质谱系统，将在一定程度上影响被测物的离子化过程，造成响应信号的抑制或提高［10，16］。本文将标准溶液峰响应设为100，则基质标准溶液峰响应=基质标准溶液峰面积/标准溶液峰面积×100，再将二者比较，从而直观地显示出基质效应的影响。结果显示：串联质谱法检测时，有些农药存在明显的基质效应（如图5所示），其中，涕灭威、异丙威、仲丁威在茶叶基质中的响应明显增强，残杀威、克百威、甲萘威则受到一定的抑制作用。而同样的前处理条件下，液相色谱法基质效应并不明显（如图6所示），因此，在用串联质谱法检测时，必须配制基质标准溶液进行定量分析才能获得准确的结果。

图5　标准溶液和茶叶基质标准溶液峰响应比较（UPLC-MS/MS）Fig.5　Comparison of peak response between standard solution and standard solution in tea matrix（UPLC-MS/MS）

图6　标准溶液和茶叶基质标准溶液峰响应比较（HPLC）Fig.6　Comparison of peak response between standard solution and standard solution in tea matrix（HPLC）

2.3方法检出限、定量限、回收率与精密度

乙腈对氨基甲酸酯类农药具有较好的溶解性，对样品也具有较强的渗透性，并且能够通过盐析达到农药在乙腈中的最大提取效率，确保回收。提取前加入足够量的水分使之充分润湿，并放置一段时间，再加入乙腈，有助于茶叶中农药尤其是极性较大农药的提取［16］，将提取溶剂体积确定为样品质量的10倍能够保证提取充分。实验对茶叶空白样品进行10种氨基甲酸酯类农药的4水平添加实验，添加浓度分别为0.01、0.05、0.1和1.0mg/kg，每个添加水平做3个平行。根据仪器灵敏度和添加回收实验，分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算方法检出限和定量限。10种氨基甲酸酯类农药的相关系数（r2）、检出限（LOD）和定量限（LOQ）见表2。经标准曲线测试，UPLC-MSMS法在0.01～0.1mg/kg范围内线性关系良好，相关系数（r2）为0.9902～0.9998，检出限为0.02～0.3μg/kg，定量限为0.07～1μg/kg；HPLC法在0.05～1.0mg/kg范围内线性关系良好，相关系数（r2）为0.9995～0.9998，检出限为3～7.5μg/kg，定量限为10～25μg/kg。

表2　10种氨基甲酸酯类农药的相关系数（r2）、检出限（LOD）和定量限（LOQ）Table 2　Correlation coefficients（r2）、LOD and LOQ of 10 carbamates

茶叶中10种氨基甲酸酯类农药的添加回收率与精密度见表3。UPLC-MS-MS进行0.01、0.05和0.1mg/kg添加水平的测定，加标回收率为75.2%～115.6%，相对标准偏差（RSD）为4.4%～16.7%。HPLC进行0.05、0.1和1.0mg/kg添加水平的测定，加标回收率为82.7%～120.7%，相对标准偏差（RSD）为0.8%～12.9%。结果表明，液相色谱-串联质谱法和液相色谱法在其添加范围内均能获得较好的准确度和精密度。经氨基SPE小柱净化后，液相色谱-串联质谱法无杂质干扰，而液相色谱法检测时，异丙威与杂质峰未达到基线分离，给色谱峰积分、定量带来一定困难（如图1所示）。

3　结论

经过比较，在相同的前处理条件下，用液相色谱-串联质谱法和液相色谱法测定茶叶中氨基甲酸酯类农药残留，均具有较好的准确度和精密度，UPLCMS-MS法3水平的加标回收率为75.2%～115.6%，相对标准偏差（RSD）为4.4%～16.7%。HPLC法3水平的加标回收率为82.7%～120.7%，相对标准偏差（RSD）为0.8%～12.9%。液相色谱-串联质谱法相对于液相色谱法有更高的灵敏度，10种氨基甲酸酯类农药在UPLC-MS-MS上检出限能够达到0.02～0.3μg/kg，HPLC法检出限仅为3～7.5μg/kg。其高灵敏度和选择性，使其更适于多农药残留同时检测和微量残留检测。但需要注意的是，茶叶基质复杂，液相色谱-串联质谱法检测时基质效应明显，必须用基质标准溶液进行定量分析，以保证结果的准确性和可靠性。

表3　茶叶中10种氨基甲酸酯类农药的添加回收率与精密度（n=3，%）Table 3　Recoveries and precisions of 10 carbamates in tea samples at three spiked levels（n=3，%）

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Comparison of UPLC-MS/MS and HPLC for determination of 10 carbamate pesticide residues of tea

ZHONG Ling-li，HU Li，GUO Ling-an*，LEI Shao-rong，MAO Jian-fei，FU Cheng-ping（Analysis and Testing Center of Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，China）

The ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）and high performance liquid chromatography（HPLC）for determination of 10 carbamate pesticide residues of tea were compared.The samples were extracted with acetonitrile，and cleaned up by amino solid-phase extraction column，then determined by HPLC and UPLC-MS/MS.The results showed that，both methods had good accuracy and precision.The recoveries ranged 75.2%～115.6%by UPLC-MS/MS when spiked levels 0.01～0.1mg/kg，with the relative standard deviations 4.4%～16.7%.The recoveries ranged 82.7%～120.7%by HPLC when spiked levels 0.05～1.0mg/kg，with the relative standard deviations 0.8%～12.9%.UPLC-MS/MS had higher sensitivity，compared to HPLC，LOD of 10 carbamate pesticides on UPLC-MS/MS was 0.02～0.3μg/kg，which on HPLC was 3～7.5μg/kg.UPLC-MS/MS was more suitable for detection of multiple pesticide residues and trace pesticides because its high sensitivity and selectivity.

UPLC-MS/MS；HPLC；tea；carbamate

TS207.3

A

1002-0306（2015）02-0070-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.006

2014－03－11

仲伶俐（1982-），女，硕士研究生，助理研究员，研究方向：食品检测与分析。

郭灵安（1962-），男，本科，副研究员，研究方向：食品质量安全。