实时荧光聚合酶链式反应法检测食品中狗源性成分

高晓丽，杨昕霆，薛晨玉，王　丹，赵琳娜，侯彩云，*（.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京00083；.北京市食品安全监控中心，北京0004）

实时荧光聚合酶链式反应法检测食品中狗源性成分

高晓丽1，杨昕霆2，+，薛晨玉2，王丹2，赵琳娜2，侯彩云1，*
（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083；2.北京市食品安全监控中心，北京100041）

根据狗线粒体NADH氧化还原酶亚基2基因（ND2）中的序列设计了狗特异性引物和Taqman探针，建立了食品中狗源性成分的实时荧光聚合酶链式（Real-time PCR）检测方法。实验表明，该方法可以很好地区分狗与其他常见的14个物种，引物、Taqman探针特异性良好，检测灵敏度可达100fg，适用于食品中狗源性成分的快速鉴定。

Real-time PCR，线粒体ND2基因，狗源性成分

近年来，食品中肉制品的安全问题日益突出，如国内的“假牛、羊肉事件”、“假鸭血事件”，国外的“马肉风波”、“假鳕鱼事件”。食品中的掺杂作假现象，不仅严重侵害消费者的权益，引发对食品安全的信任危机，一些疫情的发生与传播也往往起因于不安全的动物食品［1-2］。我国针对饲料、明胶、化妆品中含有的猪、牛、羊、马、驴、兔、狗等动物源性成分制定了相关标准［3］，但关于食品中动物源性成分的检测标准并不完善。因此，建立准确、快速的食品中动物源性成分筛查方法至关重要。

国内外学者主要基于PCR方法对动物源性成分的鉴定进行了研究，大量报道了猪、牛、羊、鸡、火鸡、鸭、鹅、马、驴等常见物种的普通PCR［4-10］和荧光PCR［11-18］研究，但针对狗源性成分鉴定的研究报道还不多。Tobe等［19］基于线粒体cytb基因建立了18个欧洲常见物种（狗、猫、牛、马、驴、狐狸、山羊等）的多重PCR检测方法，能够鉴别混合肉中各物种340fg的模板DNA。Martin等［20］建立了食品和饲料中狗、猫、鼠源性成分鉴定的普通PCR方法，检测限为0.1%。我国国标中只制定了动物源性饲料中狗源性成分的普通PCR定性检测方法，检出限为0.1%［21］。

在食品中动物源性成分的鉴定方面，与普通PCR和多重PCR法相比，实时荧光PCR法具有特异性强、灵敏度高、重现性好、有效降低污染、可实时监测等优点，是目前应用较普遍的方法之一［22］。本研究设计了狗线粒体ND2基因特异性引物和Taqman探针，建立了食品中狗源性成分的实时荧光PCR检测方法。该方法可为保障食品安全、制定相应标准等提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

猪肉、牛肉、山羊肉、绵羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、鸽子肉、鹌鹑肉、兔肉等动物材料购自北京市农贸市场或超市；骆驼肉、马肉、驴肉、狗肉、猫肉等动物材料为实验室自存；20个牛羊肉串样品购自北京市农贸市场；Tris-平衡酚、氯仿、无水乙醇、异丙醇、乙酸钠均为国产分析纯；CTAB提取缓冲液（20g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.02mol/L Na2EDTA，0.1mol/L Tris-HCl，pH=8.0）、TE缓冲溶液（10mmol/L Tris-HCl，pH=8.0，1mmol/L EDTA）由本实验室配制；Taqman实时荧光PCR预混合液（Premix Ex Taq）购自宝生物工程（大连）有限公司；狗ND2基因序列特异的上下游引物、Taqman探针由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

核酸蛋白定量分析仪（分光光度计）德国Eppendorf公司；核酸自动提取仪QIA Cube美国QIA Gene公司；3K18冷冻离心机德国Sigma公司；MyiQ单色实时定量PCR仪美国伯乐公司；超低温冰箱（-40℃）Biomedical freezer日本SANYO公司；Mili-Q纯水器美国Milipore公司。

1.2动物组织基因组DNA的提取［23］

用灭菌手术剪分别剪取适量的猪肉、牛肉、山羊肉、绵羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、鸽子肉、鹌鹑肉、兔肉、骆驼肉、马肉、驴肉、狗肉、猫肉的肌肉组织，剪碎置于研钵中（注意防止交叉污染）；加入石英砂，用液氮充分研磨至粉末状，迅速取2g左右于2.0mL离心管中，立即加入1mL CTAB，混匀；置于核酸自动提取仪中加热振荡，消化30min；离心取600μL上清液于新的2.0mL离心管中，加入等体积的氯仿和Tris-平衡酚各300μL（1∶1，V/V），用力振荡5min，使其充分反应，12000r/min室温离心10min；取上清，加入600μL氯仿，同上，12000r/min室温离心10min；取上清，加10%体积3mol/L乙酸钠和2倍体积无水乙醇，轻缓颠倒数次，可见白色絮状DNA，12000r/min室温离心10min，弃上清液；加入1mL 70%乙醇洗涤沉淀2次，12000r/min室温离心10min，弃乙醇；待DNA沉淀干燥后，将DNA溶于50～100μL无菌水中，用核酸蛋白定量分析仪测定DNA浓度，置于-20℃保存备用。

1.3引物与Taqman探针的设计

根据NCBI基因数据库已注释的、不同品系的狗（Canis lupus familiaris）线粒体序列（Accession Number：NC_002008，GI：17737322）和猪、牛、山羊、绵羊、鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑、兔、骆驼、马、驴、猫等物种的线粒体序列，分析生物进化树的规律，使用DNAMAN软件比对以上所有基因序列。选择种内保守、种间差异较大的基因片段，根据引物和Taqman探针的设计原则，应用Primer Express软件，设计引物和Taqman探针，将设计的引物和探针序列在NCBI的Blast中搜索、比对，最后选取既可以保证种内保守，又能保证种间特异的狗源性成分引物和Taqman探针。

1.4引物和Taqman探针特异性的验证

以狗肉基因组DNA为阳性对照，猪、牛、山羊、绵羊、鸭、鸡等14个物种基因组DNA为阴性对照，空白对照中以水代替DNA模板。所有DNA模板的质量浓度均稀释至100ng/μL。实时荧光PCR反应体系为20μL，具体包括：Premix buffer（2×）10μL、上游引物（10μmol/L）0.5μL、下游引物（10μmol/L）0.5μL、Taqman探针（10μmol/L）1μL、DNA模板1μL、无菌水将体系补充至总体积20μL。实时荧光PCR扩增条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃延伸30s，记录荧光值，40个循环。

在实时荧光PCR中，Ct值是指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。实时荧光PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺损设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即threshold=10XSD cycle 6～15。因此，以Ct值小于35为阳性，Ct值大于35为阴性。特异性验证实验重复三遍。

1.5灵敏度和扩增效率检测

在检测该方法的灵敏度实验中，将狗肉基因组DNA溶液分别稀释为102、101、100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5ng/μL，每个浓度进行3次重复实验，设置空白对照。根据各梯度的扩增曲线Ct值，建立Ct值-lg［DNA］的标准曲线。依据扩增效率计算公式Efficiency（%）=（-1+10［-1/slope］）×100，得到PCR反应扩增效率。以Ct值为判断标准，确定检出的最低浓度，作为该反应体系的检测灵敏度。

1.6市售肉制品中狗源性成分的检测

在北京农贸市场中随机取样20个牛、羊肉串，检验是否有掺杂掺假狗肉的情况。提取样本基因组DNA，按照实时荧光反应体系，设置阳性对照、阴性对照和空白对照，进行实时荧光PCR反应。

2　结果与分析

2.1阳性物种样本的鉴定

以CO1基因的DNA条形码［24-25］扩增狗肉基因组DNA，并对扩增产物进行测序。将测序结果在NCBI中Blast搜索，结果如图1所示。序列相似性为99%，从而确定狗物种样本的真实性。

2.2引物和Taqman探针的特异性检测结果

在特异性实验中，用狗ND2基因特异性引物和Taqman探针体系分别扩增猪肉、牛肉、山羊肉、绵羊肉、鸭肉、鸡肉、鹅肉、鸽子肉、鸵鸟肉、鹌鹑肉、兔肉、马肉、驴肉、猫肉的基因组DNA模板。结果表明，非目标物种基因组DNA的扩增曲线的Ct值均大于35，说明狗引物和Taqman探针特异性良好，如图2所示。

2.3灵敏度、扩增效率检测结果

以10倍为稀释梯度，狗基因组DNA分别稀释为102、101、100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5ng/μL。在10-5ng/μL浓度下，未检测到目标物种。在102～10-4ng/μL浓度范围内，建立Ct值-lg［DNA］的标准曲线，如图3所示。标准曲线的R2为0.9957，线性相关度良好。PCR反应扩增效率为108%。DNA浓度为10-4ng/μL时，Ct值为34.6。该引物、Taqman探针的实时荧光反应体系可检出10-4ng的模板DNA量。因此，灵敏度为100fg。

2.4市售样本的检测结果

在对市售的20个牛、羊肉串检测实验中，设置阳性对照、阴性对照和空白对照。检测样本、阴性对照、空白对照中并未检出狗源性成分，阳性对照扩增曲线完好。说明，狗引物、Taqman探针具有很强的实际应用价值。

3　结论与讨论

线粒体DNA是高等动物唯一的核外遗传物质，是检测中比较理想的靶基因，而且细胞中均含有大量的线粒体。目前，国内外学者关于线粒体的测序及其他研究已经非常透彻，在NCBI基因数据库中有大量已发表并做注释的线粒体序列，便于针对不同的物种进行引物和探针的设计。目前，国内外学者主要以线粒体中cytb、D-loop、12S rRNA、16S rRNA、ND1、ND2等基因作为目标基因位点，本研究通过筛查狗线粒体中的不同基因，并将设计的引物和探针序列在NCBI的Blast中搜索、比对，最终在狗线粒体ND2基因位点上，发现既可以保证种内保守，又可保证种间特异的引物和探针序列。因此，选取了狗线粒体ND2基因序列片段设计了引物和Taqman探针。

图1　DNA条形码扩增产物在NCBI中Blast搜索比对结果Fig.1　Sequence alignment of sequence amplification product

图2　狗源性引物探针实时荧光PCR的特异性检测结果图Fig.2　Specific detection of real-time PCR for dog

图3　Ct值-lg［DNA］的标准曲线Fig.3　Standard curve showing ct values in relation to the concentration of initial target gene copies

在实际样本的检测中，通过阳性对照、阴性对照和空白对照实验，检测样本中并未检出狗源性成分。需要注意点是，由于该方法的灵敏度较高，根据动物源性成分检出量，不能判断是意外污染还是蓄意添加。因此，需要结合其他方法进一步实验，以便更好的判断掺杂作假的程度。此外，该Taqman探针的荧光PCR反应体系是否适用于肉骨粉、明胶、化妆品中的狗源性成分的检测，还有待于进一步验证。

总之，狗ND2基因特异性引物、Taqman探针的荧光PCR反应体系特异性好，灵敏度高，稳定性强，实用性强，适用于食品中狗源性成分的检测，可为食品安全检测、打击掺假掺杂等违法行为提供技术参考。

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Detection for dog-derived components in foods by real-time polymerase chain reaction

GAO Xiao-li1，YANG Xin-ting2，+，XUE Chen-yu2，WANG Dan2，ZHAO Lin-na2，HOU Cai-yun1，*
（1.School of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；2.Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring，Beijing 100041，China）

A rapid and highly species-specific real-time polymerase chain reaction（PCR）assay had been developed for the detection of dog-derived components in meat and meat mixtures.Primers and Taqman probe were designed on the mitochondrial ND2，and the performance of the method was tested.Results showed that no cross-reaction was observed between the dog and non-target species，and this method revealed a high sensitivity and could detect 100fg of dog template DNA.In conclusion，this real-time PCR assay could be a rapid and straightforward method for the accurate identification of dog-derived components in food.

Real-time PCR；mitochondrial ND2 gene；dog-origin ingredient

TS201.6

A

1002-0306（2015）02-0061-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.004

2014－04－09+为并列第一作者

高晓丽（1990-），女，硕士研究生，研究方向：农产品加工与贮藏。杨昕霆（1986-），男，硕士研究生，研究方向：动物源性成分检测。

侯彩云（1963-），女，博士研究生，教授，研究方向：食品科学与加工技术。

北京市科技计划课题（Z131100005613005）。