术中荧光引导技术在泌尿外科应用的现状

杨晓峰

山西医科大学生物医学工程研究中心，太原 030001

*论著——生物医学影像*

术中荧光引导技术在泌尿外科应用的现状

杨晓峰

山西医科大学生物医学工程研究中心，太原 030001

本文根据微创泌尿外科发展的趋势，结合文献深入研究了术中荧光成像引导外科手术的理论和技术体系，阐述了术中荧光成像引导技术的工作原理，明确了临床可以使用或临床前期使用的荧光示踪剂，同时全面分析了国内外术中荧光成像设备的技术性能和应用范围，以及在泌尿外科手术中应用的现状，提出了进一步深入研究的科学问题。

荧光成像；荧光示踪剂；荧光成像设备；肿瘤；泌尿外科

内窥镜诊疗技术高度发展的今天，泌尿系统各种肿瘤都可以采用内窥镜或机器人微创切除。手术过程中，医生主要根据组织的色泽、形态识别肿瘤和正常组织，判断切除范围和切缘阳性率与医生的临床经验密切相关，所以需要研究定性、定量和靶向识别肿瘤的新技术，以提高手术治疗效果。目前医生可以借助术中内窥镜超声[1]、γ射线探测[2]和术中荧光成像引导识别，其中荧光成像技术(Fluorescence Imaging)由于其分辨率高，对人体无辐射损伤等优点[3]，近年来发展十分迅猛，术中荧光成像引导外科手术（Intraoperative Fluorescence -Guided Surgery）将进入临床[4.5]，成为未来泌尿外科常用的诊疗技术。现就有关术中荧光成像引导外科的理论和技术，及其在泌尿外科的应用综述如下：

1　 术中荧光成像引导技术及其工作原理[5，6]

术中荧光成像引导技术是指在外科手术前或术中将外源性靶向或非靶向荧光示踪剂通过静脉注射、局部注射或器官腔内灌注，使荧光示踪剂在手术时聚集到肿瘤组织、回流到淋巴管和淋巴结或进入血液时，荧光成像系统发射特定波长激发光，激发体内荧光示踪剂发射荧光，同时被体外荧光成像系统摄取，将光信号换化为电信号，视频显示肿瘤组织、淋巴结、淋巴管、血管或神经组织结构的功能影像，引导医生进行外科手术的临床技术。

2　 荧光示踪剂

早在1924年Policard首先发现肿瘤组织能够发射自体荧光，1948年Figge等发现恶性肿瘤组织中有荧光物质，1961年Lipson等首次采用荧光内窥镜成功识别肿瘤组织。然而自体荧光十分微弱，外源性荧光示踪剂能够增加肿瘤细胞内荧光物质的聚集，增强肿瘤的荧光强度，实现外科手术的荧光引导。目前美国FDA批准临床应用的荧光示踪剂主要是原卟啉Ⅸ(PpIX)的前体物质 — 5-氨基酮戊酸(5-Aminolevulinic Acid，5-ALA)及其酯类衍生物氨基酮戊酸己酯(Hexaminolevulinate，HAL)，荧光素钠（Fluorescein Sodium）和吲哚青绿（Indocyanine green，ICG) 。其他FDA没有批准，但在泌尿外科进行研究的示踪剂还有金丝桃素（hypericin）和多模态示踪剂ICG-99mTc-纳米胶原等[7]，其荧光特性和临床应用如下。

表1　泌尿外科荧光成像引导术中常用的荧光示踪剂及其特性

2.1原卟啉Ⅸ

5-ALA及其HAL本身不产生荧光，仅是细胞内血红素生物合成的起始物资，在细胞线粒体呼吸链中，甘氨酸由琥珀酸单酰辅酶A催化合成5-ALA，5-ALA在胞浆中经由卟胆原、尿卟啉原川、粪卟啉原川，再回到线粒体中由原卟啉原Ⅸ合成原卟啉Ⅸ（PpIX），在亚铁螯合酶的作用下合成血红素。血红素的聚集又负反馈抑制5-ALA合成。在此通路中，只有原卟啉Ⅸ是具有荧光特性的物质，在正常情况下细胞中的原卟啉Ⅸ是中间产物，通常不会聚集。当外源性5-ALA增加时，PpIX在肿瘤细胞聚集[8]，具备产生荧光的条件。5-ALA诱导内生的PpIX可以选择性的吸收波长为375～440nm的光跃迁为激发态，激发态的PpIX分子释放热能和新光子，新光子能量较低，形成波长为635～700nm的红色荧光，利用内窥镜可以看到发射红色荧光的肿瘤[9]。

2.2荧光素钠

荧光素钠是一种合成荧光染料，激发光是488nm，发射光是530nm的绿色荧光，非常明亮，量子效率为0.76。由于和粉红色的膀胱粘膜相比有很大差异，所以荧光素钠是一种很好的荧光示踪剂。激光共聚焦内窥镜检查膀胱时使用荧光素钠成像，与白光结合能够在显微水平识别膀胱肿瘤和良性膀胱粘膜上皮细胞。荧光素钠的使用有静脉注射和膀胱灌注2种方式，但在泌尿系统检查时常采用膀胱灌注的方法，这种方法全身毒副作用最低，荧光素钠能快速着色于细胞外基质[10]。

2.3吲哚青绿

目前术中荧光成像引导使用最为广泛的是近红外荧光示踪剂吲哚青绿，其发射光是820～830nm，激发光是780nm，水溶液中的量子产率是0.0028。静脉注射后立刻与血浆蛋白结合，结合率达95%，导致ICG荧光性能增强（量子效率0.012），激发光峰值红移位25nm。ICG 为非靶向荧光示踪剂，具有血管池效应，不与肿瘤细胞特异性结合，而是聚集于血管丰富的组织，半衰期为3～4min，可以重复使用，最大剂量为2mg//kg。ICG的发射光肉眼看不见，近红外CCD成像形成白色图像[11]，但为了和手术野血色的组织结构有明显的区别，一些荧光成像设备中，通过计算机软件处理使ICG图像添加了伪色，颜色为黄绿色，与手术野的颜色有明显的区别[6]。同时ICG具有良好的安全性，过敏性反应的发生率﹤0.05%。

2.4金丝桃素

金丝桃素能够激发649 nm的红色荧光，激发光峰值波长598nm，量子效率0.02，全身毒性小，在恶性肿瘤组织中累积，然而金丝桃素不溶于水，仅溶解乙醇和1%血浆蛋白溶液中。最近研究表明与ALA和HAL相比金丝桃素诊断膀胱肿瘤的敏感性是82～94%，特异性是91～94%[12]。Kubin等[13]报道采用聚乙烯吡咯烷酮包裹金丝桃素后，使金丝桃素具有了水溶性。

2.5其他荧光示踪剂

按照Nguyen等[4]的研究分析外源性荧光示踪剂还可以分为非靶向荧光示踪剂类、氨基酸和多肽类、以及人工合成的大分子等，但肿瘤靶向特异的荧光示踪剂将是今后研究的一个热点。

3　 术中荧光成像设备[14]

2002年美国波士顿Beth Israel Deaconess医学中心首先介绍了第一代外科成像系统，当时主要用于外科手术的动物研究，近年来逐渐进入临床。目前美国波士顿Frangioni实验室、日本滨松光电、法国Fluoptics公司、加拿大和荷兰等研究机构正在从事相关研发。美国FDA批准临床应用的有SPY。同时我国第一台多光谱分光融合外科手术引导系统开始临床应用。

表2中列出15种成像设备，分为开放手术系统、腹腔镜系统和显微成像系统三大类，虽然硬件和软件配置上有一定差异，但工作原理基本一致。

表2　荧光成像设备及其技术性能

3.1术中荧光成像系统的基本结构

术中荧光成像系统主要包括特定波长激发光源、滤光片、高灵敏荧光摄像机、计算机及其图像处理软件等。

3.2术中荧光成像系统技术性能

（1）FLARE™摄像系统由美国波士顿Beth Israel Deaconess医学中心和乔治亚州立大学在2002年研制成功，FLARE是 Fluorescence - Assisted Resection and Eexploration的缩写，即荧光辅助切除和探测。FLARE™能够在外科手术时，显示外科手术野的解剖结构，还能显示肉眼看不到的近红外荧光，同时两者可以图像重叠。FLARE™系统有400～650nm、656～678 nm和745～779 nm 3种光源，成像系统包括400～650 nm，689～725 nm和800～848 nm 三种波长响应的CCD。主要适用于各种开放手术。

（2）Fluobeam®是法国Fluoptics公司研制，是一种手持式成像系统，有一个花冠状LED发射近红外光，能够在白光下直接检测。Fluobeam®分为Fluobeam® 700和Fluobeam® 800 两2种型号[15]。

（3）Artemis™手持式成像系统是彩色和荧光双重CCD手持式摄像系统，实现全彩实时荧光成像，也具有700nm和800nm 2种成像功能，适用于腹腔镜和开放手术。

（4）The Photodynamic Eye是有日本滨松光电研制，主要进行非损伤床旁定量评估组织灌注量，发射光源是波长为760 nm的 LED ，单色CCD，也是手持式。主要用于开放手术，使用荧光示踪剂为ICG。

（5）SPY是由加拿大 Novadaq Technologies Inc.研制，是第一个，也是目前唯一一个被FDA许可进行心脏冠状动脉搭桥术后评估通畅度的设备，整个系统被放置在一台移动车上，激光输出功率2.0 W，摄像机是30帧频/秒的CCD，照射心脏的面积是56 cm2 (7.5 cm×7.5 cm) ，工作距离30cm[16,17]。同时也是评估游离皮瓣血运的重要工具[18,19]。还可应用于器官移植，小儿外科和泌尿外科等领域。

（6）多光谱分光融合外科手术引导系统是我国自行研制设计的新一代荧光成像引导系统，可将手术野同一部位、同一时刻组织表面的解剖学图像和组织内的近红外荧光功能图像分光摄像和图像融合，实现同一部位多光谱、多种影像的图像融合和影像识别，在外科手术中进行精密定位和手术导航，准确显示残余肿瘤、淋巴管和血管，实现术中靶向识别。将主要应用于人体各部位肿瘤外科切除术中残余肿瘤的探查和识别、肿瘤前哨淋巴结定位、以及术中血管、淋巴管和淋巴结的探测[20]。

4　 泌尿外科的应用

4.1原卟啉Ⅸ荧光引导膀胱镜检查

目前研究明确认为膀胱内灌注5-ALA或HAL，进行PpIX荧光引导膀胱镜检查的灵敏度是95%，而白光膀胱镜是70%[21,22]。5-ALA和HAL灌注行经尿道膀胱肿瘤切除术后肿瘤的复发率是一致的，两者没有差异[7]。PpIX荧光引导膀胱镜检查的主要缺点是特异性相对较低，5-ALA 的假阳性率达38%[23]，假阳性率与膀胱炎症、化疗和近期经尿道肿瘤切除术有关，同时与泌尿外科医生的学习曲线和经验密切相关[24]，同时随着检查时间的延长，荧光强度也逐渐下降。为了克服 5-ALA或HAL特异性较低的缺点，阻止PpIX 的降解，François等[25]制备了ALA树枝状大分子复合物，发现这种复合物使ALA的水解速度减慢，体内存留时间延长，能够持续合成PpIX，使荧光持续时间＞24小时，而且使PpIX的组织渗透深度增加，没有全身重吸收，可以替代ALA成为一种新的荧光示踪剂。Yan等[26]应用纳米沉淀技术制备载有5-ALA的纳米粒子，研究表明5-ALA纳米粒子对膀胱肿瘤细胞有光动力杀伤效应。

4.2原卟啉Ⅸ荧光引导激光治疗阴茎肿瘤

阴茎肿瘤治疗的常规方法是阴茎部分切除术或阴茎全切术，对于年轻患者保留阴茎外观和性功能更加重要，但由于肿瘤的浸润性，切除和保留之间选择十分困难，保留阴茎生活质量提高，又有肿瘤局部复发的潜在危险，而保留阴茎的局部治疗复发率达3.1%～48%。德国采取保留阴茎的激光治疗已经有30年的经验，2002年Frimberger等[27]开展了荧光引导诊断阴茎肿瘤的初步研究，最近Schlenker等[28]研究1999年到 2005年的26例病人，其中原位癌前期病变(Tis)11 例，浸润性阴茎肿瘤15例，采用荧光引导的激光治疗，随访 71.1 月( 41-104月).复发率是4 例(15.4%)，研究认为荧光引导激光治疗阴茎肿瘤保留阴茎外形和功能的方法能够降低复发率，但仍然需要多中心大规模的临床验证。

4.3 原卟啉Ⅸ荧光引导根治性前列腺切除术

2008年Zaak等[29]首先报告了根治性前列腺切除术中，5-ALA诱导识别手术切缘的研究结果，18例前列腺癌患者(Gleason评分4-8，PSA 1-20 ng/mL)，其中16例在前列腺根治术前2小时口服5-ALA (20 mg/kg)，2例为对照组，所有标本都进行荧光显微镜和光谱分析，16例中有10例病人进行手术切缘的研究，研究认为前列腺癌细胞中有PpIX聚集，而良性上皮细胞和间质中仅有微弱的PpIX荧光。还有认为在手术前3小时应用5-ALA，对于确定阳性切缘仍然有效[30]。日本学者研究确定根治性前列腺切除术中采用PpIX-荧光引导识别，阳性切缘的特异性和敏感性是82% 和69%[31]。

4.4ICG荧光成像引导肾部分切除术

ICG是近红外荧光血管成像最主要的近红外荧光示踪剂。Tobis等[32]使用SPY内窥镜成像系统进行腹腔镜和机器人辅助肾部分切除术术中肾肿瘤边缘的识别，认为该技术进一步完善将有助于减少术中并发症的发生，同时发现即使是ICG重复注射也不会超过最大使用剂量。

4.5ICG荧光成像评估移植肾血流灌注

Hoffmann等[33]设计了激光辅助吲哚青绿荧光摄像系统评估肾移植术中移植肾的血流灌注，认为该技术简易，安全、敏感性高。

4.6ICG和多模态ICG-(99m)Tc-纳米粒子引导前列腺

癌前哨淋巴结示踪

Yuen等在66例前列腺癌根治性术中经直肠注射ICG进行近红外成像，其中65例（98%）成功看到淋巴管，65例（97%）找到淋巴结，认为该技术安全、有效、缩短了手术时间[34]。van der Poel等[35]应用多模态ICG-(99m) Tc-纳米粒子，术前注射到前列腺进行淋巴结闪烁成像和SPECT/CT成像确定淋巴结的位置，术中采用荧光腹腔镜识别术前确定的结节，结果表明多模态ICG-(99m)Tc-纳米粒子和荧光腹腔镜结合将有助于前列腺根治术中前哨淋巴结的识别。

4.7膀胱癌前哨淋巴结示踪

浸润性膀胱癌有20～25%的病人有淋巴结转移，在进行膀胱全切术时要进行淋巴结清扫。Knapp等采用IRDye™ 800CW、HSA800、近红外荧光量子点三种近红外荧光淋巴结示踪剂，其中HSA800的激发光峰值是784 nm， 发射光峰值是802 nm；近红外荧光量子点的激发光峰值是775 nm, 发射光峰值是820nm。使用第一代近红外荧光成像系统，在家犬和猪上进行试验研究，发现注射近红外荧光淋巴结示踪剂后膀胱壁立刻出现明亮的荧光，10秒淋巴管荧光显示，30秒到3分钟前哨淋巴结显影，在注射后2小时注射部位和前哨淋巴结仍然荧光显影。其中25%的淋巴结全部明亮荧光显影；45%的淋巴结部分显影；30%的淋巴结边缘斑点显影。同时研究发现，膀胱内压力影响淋巴结示踪剂的移动，大于 50 cm H20和小于 10 cm H2O都没有淋巴结示踪剂的移动，膀胱内压力是影响膀胱光学效果的重要因素[36]。

4.8输尿管损伤的诊断

在输尿管损伤或某些外科手术时，输尿管寻找十分困难，Tanaka等使用0.5 mW/cm2 400～700 nm的白光，和5mW/cm2 725～775 nm的近红外光，光斑直径是15厘米的近红外成像系统研究发现，在猪模型中注射7.5 μg/ kg CW800-CA，能够在不可见光下看到输尿管，看到输尿管内直径小于2.5 mm的异物，逆行注射10 μM ICG能够精确定位输尿管损伤的漏尿点[37]。

5　 展 望

泌尿外科无论是开发手术还是内窥镜手术，都离不开光学照明或光学成像，其中内窥镜手术更多，这就为荧光成像在泌尿外科的广泛应用奠定了一定基础，今后研究的重点将是开发肿瘤靶向特异性的荧光示踪剂以及成像性能良好的光学分子影像设备。

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Intraoperative Fluorescence Guidance in Urology

YANG Xiaofeng
Biomedical Engineering Research Center, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001

According to the development of minimally invasive surgery, we researched the theory and technical system of intraoperative fl uorescence imaging guided urology. The operational principle of fl uorescence imaging guided surgery and fl uorescent tracer were described. The technical performance and application scope of fl uorescence imaging device at home and abroad were analysed comprehensively in urology. We put forward the scientifi c problems for further research.

fl uorescence imaging; fl uorescent tracer; fl uorescence imaging device; tumor; Urology

R651.1

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2015.01.01.14

2015-02-28；

2015-03-10

国家自然科学基金资助（编号81172444 ）

杨晓峰，教授，研究方向为泌尿系统肿瘤诊治，Email：yxfylq@163.com

引用格式：杨晓峰. 术中荧光引导技术在泌尿外科应用的现状 [J].世界复合医学, 2015,1(1):79-84.