基于穆勒矩阵的偏振显微镜及其在生物医学领域的应用

王晔1,2，何宏辉11311,21,21,2，曾楠，谢军，廖然，常金涛，孙明皓，马辉

1. 清华大学 深圳研究生院，深圳市无损监测与微创医学技术重点实验室，深圳 518055 2. 清华大学 物理系，北京 100084 3.海南大学 机电工程学院，海口570228

*论著——生物医学影像*

基于穆勒矩阵的偏振显微镜及其在生物医学领域的应用

王晔1,2，何宏辉11311,21,21,2，曾楠，谢军，廖然，常金涛，孙明皓，马辉

1. 清华大学 深圳研究生院，深圳市无损监测与微创医学技术重点实验室，深圳 518055 2. 清华大学 物理系，北京 100084 3.海南大学 机电工程学院，海口570228

偏振光显微镜可用于观察具有光学各向异性特征的样品，因而在诸多领域都得到广泛应用，例如研究地质岩石和矿物，分析壁画颜料，检验纺织品和生物组织等。在生物医学研究领域，偏振光显微镜能提供比普通光成像更丰富的微观结构信息，是一种有潜力的疾病诊断手段。然而在实际应用中各向异性样品的取向会对偏振测量产生一定影响。最近，我们设计了一种基于穆勒矩阵的全偏振显微镜，其主要依据穆勒矩阵双波片旋转测量方法[1]，通过在普通显微镜上添加起偏和检偏装置零件，利用计算机控制双波片旋转并定时采集图像，最后处理图像获取被观测样品的穆勒矩阵。通过后续对所获偏振图像进行分解、变换等处理，我们可以减少样品取向对偏振测量产生的影响，更有效的获取样品微观结构信息。基于穆勒矩阵的全偏振显微镜具有结构简单，测量快速，精度高等优点，有良好的开发应用前景。文中将详细介绍此种显微镜的原理，计算方法，误差校准，并演示其在生物医学样品的测量结果。

偏振光，显微镜，穆勒矩阵

1　 装置与原理

显微镜装置如图1所示，本文所使用的为透射式显微镜（科信L2000）。根据样品的实际情况，还可采用反射式显微镜对厚样品表面进行成像。加装在显微镜光路中的起、检偏模块主要由一对偏振片和四分之一波片组成，其中起偏模块由偏振片P1和四分之一波片R1组成一组偏振产生器P，检偏模块由偏振片P2和四分之一波片R2组成一组偏振分析器A。显微镜采用红光LED作为光源（中心波长632 nm，带宽50 nm），光源产生光强稳定的光束经过偏振产生器P，照射到载物台的样品上，经过物镜放大，最后经过偏振分析器A分析其偏振态，并通过辅助镜成像到 CCD（Qimaging RETIGA EXi，12位，696×520像素）上探测出其出射光的强度，CCD在特定位置获取30幅偏振图像，即可通过后续数据处理反推出被测样品的穆勒矩阵。本文中实验测量时固定起偏和检偏模块中的偏振片，并以1 :5的角度同步旋转两个四分之一波片来调制入射光和出射光的偏振态。穆勒矩阵是一种能完全描述样品偏振光学属性的表征方法，当我们使用一个四分量的斯托克斯矢量表示入射和出射光的偏振状态时，介质的偏振特征就可以通过4×4的穆勒矩阵表示。穆勒矩阵包含了样品大量微观结构信息，由于能表征部分偏振光，因此斯托克斯矢量-穆勒矩阵表示法特别适合具有散射退偏效应的生物组织成像分析[9]。

图1　基于穆勒矩阵的全偏振显微镜实物图及示意图Fig.1　Full polarization microscope based on Mueller matrix method

2　 实验测量与数据处理方法

2.1测量方案

本研究采用穆勒矩阵作为偏振显微镜测量方案。目前的穆勒矩阵测量方法主要有三种：直接测量法、半自动测量法、全自动测量法[10]。直接测量的原理主要是通过调整两个四分之一波片的方位角，获得16个以样品穆勒矩阵的各元素为未知数的线性无关方程组，最终求解方程组获得样品穆勒矩阵。半自动测量法的原理是检偏零件的四分之一波片R2每转动一个方位后，使其固定，并以一定的角速度旋转起偏零件的四分之一波片R1，同时探测器以一定的频率接收光强。通过多次转动波片R2，即可获得一系列关于样品穆勒矩阵各元素的线性方程组，最终由最小二乘法计算可获得样品的穆勒矩阵。这两种方法的缺点是都需要手动调节波片旋转，测量引入的误差较大，测量所需的时间也较长。本文中采用的是全自动测量法，即双波片旋转穆勒矩阵测量法，它主要通过电脑控制，测量引入的误差较小，且测量时间可以根据电机转速和探测器的响应周期调节，测量时间可以很短。本文所使用的显微镜装置目前一次测量时间约为2分钟。下面是双波片旋转测量方法[1]的主要工作原理：

由图1可知出射光强表达式为：其中：Sin是入射光的斯托克斯矢量，MP1，MR1分别是起偏器件偏振片P1和四分之一波片R1的穆勒矩阵，

MP2，MR2分别是检偏器件偏振片P2和四分之一波片R2的穆勒矩阵，Sout是入射光经过样品和检偏器件后的斯托克斯矢量。

令起偏模块矩阵为：

检偏模块矩阵为：

注射用血塞通对MCA粥样硬化性血管狭窄伴MES阳性TIA患者MES和血脂水平的影响 …………… 史 敏等（4）：512

则

则得得：：

其中C=ωt， C' =5ωt 分别为两个波片所转的角度，那么依据傅里叶变换：

易知：Iout的傅里叶系数是样品穆勒矩阵Msample中各个元素mij的线性函数，那么通过傅里叶变换即可获得各系数an，bn，继而通过解一系列的线性方程组可获得样品穆勒矩阵Msample中的所有元素。

2.2数据处理方法

在本文实验中数据主要进行了穆勒矩阵分解处理。穆勒矩阵共有16个阵元，它包含了介质的全部偏振信息，但穆勒矩阵元并没有清晰的物理意义，需要经过特定处理才能转化为与微观结构存在对应关系的偏振参数。对于穆勒矩阵的整体性研究比较复杂，各个阵元并非完全独立，因而穆勒矩阵分解就显得尤其重要，如果可以将穆勒矩阵分解为体现不同光学性质的参数，将有利于对样品偏振特性的定量分析。目前最为主流的穆勒矩阵分解方法是由Shih-yau Lu和Russell A. Chipman提出的极化分解方法（Mueller matrix polar decomposition）[11]。此方法依据偏振介质传输的三个特性：二向色性（即与偏振有关的强度衰减性质）、相位延迟（即与偏振有关的位相改变性质）和散射退偏（即偏振光转化为非偏振光的性质），将穆勒矩阵分解为三个因子的乘积。通过分解得到的子矩阵可以独立体现介质的偏振特性。穆勒矩阵极化分解表达式如下：

式中所获三个子矩阵分别为：

M△——样品对于入射光的退偏振矩阵

MR——样品对于入射光的位相延迟矩阵，

MD——样品对于入射光的振幅双向衰减矩阵，

m ——各个标准矩阵的 3×3阶子矩阵。

2.3装置校准

为了保证装置测量结果的可靠性，我们首先对穆勒矩阵偏振显微镜进行了误差分析和校准。根据图1所示显微镜装置结构可知装置误差的可能来源主要有：光源、偏振器件、物镜、辅助镜、CCD以及装置本身其他未知因素。为了消除不同误差来源对成像结果造成的影响，我们首先对装置进行了校准，即测量偏振性质已知的样品。图2所示为对空气进行测量获得的穆勒矩阵Mair，理论上空气的穆勒矩阵应为单位矩阵，通过比较实际测量值和理论值我们可获得系统的误差矩阵M'，得I=M’Mair。由此经过校准后的样品穆勒矩阵如下式：

式中Mcorrect为样品真实穆勒矩阵为系统装置误差校准矩阵，Mcorrect为装置实际测量的样品穆勒矩阵。

图2 （a）校准前的空气穆勒矩阵（b）校准后的空气穆勒矩阵Fig.2　Mueller matrix of air

图2显示了偏振显微镜测量空气穆勒矩阵校准前与校准后的结果，可以看到校准后，空气测量结果更为接近单位矩阵，其各个阵元测量误差在1% 以下，上述结果表明经过误差校准后的穆勒矩阵偏振显微镜测量结果是可靠的。

3　 实验结果与分析

在进行了误差校准后，我们选择了一些有代表性的样品进行穆勒矩阵显微成像，本节将展示藻类细胞、人体癌变组织等的成像效果，并进行分析。

3.1藻类

近年来藻类污染已成为一个全球性问题，对水体中藻类等微生物进行分类具有非常重要的生物学意义[12,13]，本文选取了一种藻类-三角褐指藻进行显微成像，以显示偏振方法进行藻类形态鉴别的潜力。图3为100倍物镜观测下藻悬浮液某区域单个三角褐指藻的穆勒矩阵分解所获的散射退偏参数图，图4为100倍物镜观测下藻悬浮液某区域多个三角褐指藻堆积的穆勒矩阵分解所获的散射退偏参数图。从图3及图4中可看到三角褐指藻的轮廓与内部结构差异所导致的散射退偏值差异，表明散射退偏可获取藻类样品的边界及微观结构信息。

图3　单个三角褐指藻散射退偏参数图（100X）Fig.3　Depolarization of single Phaeodactylum tricornutum

图4　多个三角褐指藻散射退偏参数图（100X）Fig.4　Depolarization of multiple Phaeodactylum tricornutum

图5　厚度为28μm无染色的宫颈鳞状上皮癌切片的穆勒矩阵分解参数图，红色虚线区域大致为癌变区域（a）二向色性参数图（b）散射退偏参数图（c）线性相位延迟参数图(4X)Fig.5　Mueller matrix polar decomposition imaging results of cervical cancer tissue

图6　厚度为28μm无染色的甲状腺癌切片的穆勒矩阵分解参数图，红色虚线区域大致为癌变区域（a）二向色性参数图（b）散射退偏参数图（c）线性相位延迟参数图(4X)Fig.6　Mueller matrix polar decomposition imaging results of thyroid cancer tissue

3.2癌变组织

近年来恶性肿瘤发病率逐年上升，成为人类健康的最大威胁之一。上世纪90年代有学者开始尝试将偏振方法应用于癌症的诊断[14-16]，由于癌症早期大多起源于浅表组织，偏振光成像方法能有效提高浅层组织的成像质量，因此偏振方法具有成为癌症早期检测手段的潜力。最近偏振光成像方法已被初步用于肠癌、宫颈癌、甲状腺癌、皮肤癌等的检测，本文选择了两组有代表性的癌组织切片作为样品，进行反射式显微成像。图5所示为4倍物镜观测下未经染色处理的甲状腺癌切片的穆勒矩阵分解参数图，图6所示为4倍物镜观测下未经染色处理的宫颈鳞状上皮癌切片穆勒矩阵分解参数图，图中红色虚线标识的区域大致为癌变区域。从图5（c）可以看到，样品的线性相位延迟参数值整体较小，基本趋近于0，而左下有一小块区域的值明显比其他区域偏大。根据对相应染色切片进行的病理学诊断可知，该样品绝大部分为宫颈鳞状上皮癌组织，只有左侧一小区域为正常的宫颈组织，这与其线性相位延迟的区域分布特征吻合，表明宫颈癌的癌变区域线性相位延迟值小于正常区域数值。图6（a）和（b）显示了甲状腺癌组织切片癌变区域的二向色性参数值明显大于正常组织区域的数值，而癌变区域的散射退偏参数值则明显小于正常区域的数值。图5及图6表明穆勒矩阵分解参数能很好地区分部分癌变和正常组织。近期相关研究结果已显示，穆勒矩阵元以及变换参数同样具有癌变等病变检测的潜力[17]。

图3-图6所示的实验结果表明：利用基于穆勒矩阵的全偏振显微镜可以获取样品大量的结构信息，包括样品的散射退偏、二向色性、相位延迟等参数，从中可获取生物组织的病理变化特征，具有癌症检测的潜力。除此之外，通过对穆勒矩阵进行更全面的变换处理，我们还可以获得样品的各向异性、角度取向等信息[18]，以应用于生物医学领域的研究。

5　 结 论

本文基于双波片旋转穆勒矩阵测量法发展了一种全偏振显微镜，并介绍了装置结构，测量方法和数据处理方法。通过对偏振显微镜进行误差校准，装置的测量误差可达到1% 以下。通过对生物组织等进行穆勒矩阵成像，我们验证了偏振穆勒显微镜装置的可靠性，并发现可以通过偏振穆勒显微镜获取多种样品的结构信息与光学特性。由于基于穆勒矩阵的偏振显微镜具有测量快速、无损、获得的信息量丰富的优点，且成本较为低廉，因此其具有广泛的生物医学应用前景。

（References）

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Polarized Light Microscopy Based On Mueller Matrix and its Applications on Biomedical Studies

WANG Ye1,2, HE Honghui1, ZENG Nan1, XIE Jun3, LIAO Ran1, CHANG Jintao1,2, SUN Minghao1,2, MA Hui1,2*
Shenzhen Key Laboratory for Minimal Invasive Medical Technologies, Graduate School at Shenzhen, Tsinghua University, Shenzhen 518055, China Department of Physics, Tsinghua University, Beijing 100084, China Mechanical and Electrical Engineering College, Hainan University, Haikou 570228, China

Polarized light microscopy is widely used in observation of optical anisotropic characteristics of samples. It has been applied to the studies in many fi elds, such as the geology of rocks and minerals, analysis of mural pigment, inspection of textiles, and detection of biological tissues. In biomedical studies, polarized light microscopy can provide rich micro structural information, which can be useful for the detection of abnormal tissues. However, the orientation distribution of anisotropic samples can infl uence the polarization measurement. Recently, we designed a new type of polarized light microscopy based on Mueller matrix imaging method. In this microscopy all the elements of the Mueller matrix are simultaneously determined from the analysis in the frequency domain of the time-dependent intensity of the light beam at every pixel of the camera. The variations in intensity are created by thetwo compensators continuously rotating at different angular frequencies. Through the subsequent transformation processing of the received polarization image, we can reduce the influence of sample orientation on polarization measurement and obtain the micro structural information more effectively. With the advantages of simple structure, rapid measurement and high precision, polarized light microscopy based on Mueller matrix shows a good development prospect.

polarized light; microscopy; Mueller matrix

R730.58

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2015.01.01.13

2015-02-09；

2015-03-15

王晔，硕士研究生，研究方向为偏振散射方法在生物医学方面的应用，电子信箱：ye-wang13@mails.tsinghua.edu.cn；马辉(通信作者)，教授，博士生导师，主要研究方向包括偏振光散射理论、方法和应用、光学相干断层成像等生物医学光学方法，电子信箱：mahui@mail.tsinghua.edu.cn

引用格式：王晔，何宏辉，曾楠,等. 基于穆勒矩阵的偏振显微镜及其在生物医学领域的应用 [j].世界复合医学.2015,1（1）74—78.