芒果及番木瓜炭疽病菌在病斑外延组织中的分布检测

文 / 尉冬梅，徐 军，董丰收，刘新刚，吴小虎，郑永权

（1．农业部农产品质量安全生物性危害因子风险评估实验室，中国农业科学院 植物保护研究所，北京，100193；

2．沈阳农业大学 植物保护学院，沈阳 110161）

芒果及番木瓜炭疽病菌在病斑外延组织中的分布检测

文 / 尉冬梅12，徐 军1，董丰收1，刘新刚1，吴小虎1，郑永权1

（1．农业部农产品质量安全生物性危害因子风险评估实验室，中国农业科学院 植物保护研究所，北京，100193；

2．沈阳农业大学 植物保护学院，沈阳 110161）

为评估芒果和番木瓜感染炭疽病后的食用安全性，本文研究了胶孢炭疽菌在不同病斑大小的芒果和番木瓜中的扩散范围。以芒果、番木瓜及胶孢炭疽菌为实验材料，采用人工接菌的方法，对不等病斑大小时，病斑外延不等距离处的外延组织进行检测。结果表明，当芒果病斑直径大小为0.5cm，1cm，2cm时，在病斑及病斑外延1cm处可检测到胶孢炭疽菌菌落；当病斑直径为3cm时，病斑处及其外延2cm范围内可检测到胶孢炭疽菌菌落。当番木瓜病斑直径大小为0.5cm，1cm，2cm，3cm时均在病斑及病斑外延1cm处可检测到胶孢炭疽菌菌落，病斑外延1cm以外，未检测到胶孢炭疽菌菌落。

芒果；番木瓜；胶孢炭疽菌；分布检测

芒果、番木瓜均属热带水果，在我国主要分布在海南、云南、广东、广西、福建等省。芒果汁多肉嫩、酸甜可口、营养丰富，享有“热带果王”的美誉[1]，深受广大消费者的喜爱。番木瓜，与香蕉、菠萝并称“热带三大草木果树”[2]，果肉味甜而清香，具有丰富的营养，是制作果脯蜜饯、果汁、罐头、果酱、果冻、水果糖、冰激凌等理想的营养保健品原料，也可制成各种方便快捷食品。

炭疽病是世界范围内农业生产中发生最为普遍的病害之一，热带地区因为气温偏高，雨水充沛，湿度较大，炭疽病发生尤为严重。炭疽病是危害芒果和番木瓜的较为严重的真菌病害[3-6]，大多数由胶孢炭疽菌[7]引起，少数为辣椒炭疽菌。该病菌可引起芒果花、叶和果实的脱落，其潜伏菌使采后果实变黑腐烂，严重影响果实的产量和品质，大大缩短商品芒果的货架期[8,9]；可侵染番木瓜叶、茎和果实，是造成番木瓜田间和贮藏期果实腐烂的主要原因之一[10,11]。由于胶孢炭疽菌的潜伏浸染性，往往在采后储藏及运输时大爆发。有研究表明，不同寄主上分离的菌株可交叉侵染[12]。虽然对胶孢炭疽菌的生物学特性[13-15]，水果采后保鲜及炭疽病生物防治[6,16-18]，化学药剂的筛选[19]已有相关报道，但由于芒果及番木瓜个体较大，当表面出现病斑后可剔除病斑及其外延相应范围后继续食用或用于生产加工制品，有关炭疽菌在病斑外延组织中的扩散分布情况尚未见报道。当芒果、番木瓜被病原菌侵染后继续存放时，病原菌会从腐烂部分向未腐烂部分渗透扩散，导致表面看似健康的部分同样含有病原菌，然而通过简单的剔除腐烂斑处，不能有效控制病原菌直接被食用，或进入加工流程，带来后续隐患。为了明确芒果、番木瓜染炭疽菌后病斑大小不同时，炭疽菌在外延组织中的扩散情况，以及比较该两种不同水果基质中的扩散情况差异，进行本试验，以期为安全食用提供科学建议，为其风险情况做出评估。

1、材料与方法

1.1 材料与仪器

芒果、番木瓜均为市售大小适中，成熟度一致，无损伤，无病害。胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）由广东农业科学院植物保护研究所提供。PDA培养基，链霉素硫酸盐、利福平（Sigma公司），75%酒精等。超净工作台（北京亚太科隆有限公司），立式压力蒸汽灭菌锅（江阴滨江医疗设备厂），XW-80A 涡混合器（美国Scientific industries公司），智能人工气候培养箱（宁波海曙赛福实验仪器厂），天平（赛多利斯)等。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化 将保存的胶孢炭疽菌转接到PDA培养基上，25℃下培养7d。

1.2.2 水果清洗及接种：清水浸泡芒果及番木瓜3m in，随后清水冲洗，再用75%的酒精棉擦拭水果表面以初步灭菌。在无菌操作条件下，将活化后的胶孢炭疽菌用无菌水配置成菌悬液，采用人工接菌的方法，在芒果及番木瓜的中间偏上部位致“十字形”伤口，用移液枪将菌悬液注入伤口处50μ L，温度为25℃，湿度为90%条件下培养[20]。

1.2.3 培养基的制备：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000m l。将洗净后去皮的马铃薯切成小块，加水煮沸约30m in，用纱布过滤，加水补足1000m l，加葡萄糖和琼脂，加热使琼脂完全融化后分装，每瓶200m l，121℃下高压蒸汽灭菌30m in。对芒果样品病原菌扩散测定时，称取链霉素硫酸盐100m g溶于1m L无菌水中配成100m g/m l的母液，培养基稍凉至40℃左右时，加入上述配制好的链霉素硫酸盐母液,每瓶培养基加链霉素硫酸盐200μ L，使链霉素硫酸盐在培养基中的浓度为100μ g/m l[21]。番木瓜样品病原菌扩散测定时将链霉素硫酸盐替换成福利平，使用浓度及配制方法同链霉素硫酸盐。

1.2.4 取样及样品稀释：待病斑直径长至0.5cm、1cm、2cm、3cm时,分别取3个芒果、番木瓜进行取样。当病斑直径为0.5cm及1cm时，取样范围为：腐烂斑处、腐烂斑外延1 cm处、2 cm处、3cm处；当病斑直径2cm、3cm时，取样范围扩大至病斑外延4cm处。在无菌操作条件下，取样果皮及果肉，取样大小为1×1×1cm 3，用眼科剪和手术剪将果肉剪碎，加适量无菌水稀释制成1∶10（V/V）样品液，涡旋3 m in，取0.5m l 1∶10稀释液注入含有4.5m l无菌水的离心管中，另换一支1m l无菌吸管反复吹吸，此液为1∶100稀释液，按上述操作方法制备1∶1000稀释液[18]。

1.2.5 培养与记录 每个稀释度分别吸取1m l样品匀液于2个无菌平皿内，接种无菌水作为空白对照，另外做健康芒果及番木瓜的3个浓度的对照，及时将上述配制好含链霉素硫酸盐或利福平15-20m l冷却的PDA培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀，待琼脂凝固后，将平板倒置，在温度为25℃±1℃，湿度为90%的条件下进行培养，芒果样品稀释液培养3d，木瓜样品稀释液培养5d，观察并记录是否有菌落生长。

2、结果与分析

在抗生素的选择上，培养芒果样品稀释液时，100μ g/m l链霉素硫酸盐可抑制细菌生长。但在培养番木瓜样品稀释液时，使用链霉素硫酸盐仍有杂菌干扰，经验证100μ g/m l利福平可达到抑制细菌效果。所以，在检测芒果炭疽病斑外延组织中炭疽菌的分布时选用链霉素硫酸盐，在检测番木瓜炭疽菌病斑外延组织中炭疽菌的分布时选用利福平。

经过培养观察,检测结果如表1、表2所示，相同病斑大小时取3个芒果或番木瓜，取样后每个样品稀释液接种于两个培养皿中，相当于不同病斑大小外延不等距离处共6个平行。当芒果炭疽病病斑为0.5cm，1cm，2cm时，在病斑及其外延1cm范围内都检测到炭疽菌，当病斑为3cm时，在其外延2cm范围内可检测到炭疽菌。当番木瓜炭疽病病斑为0.5cm，1cm，2cm，3cm时，在病斑及其外延1cm范围内可检测到炭疽菌。该范围外及对照均无菌落生长。

同种水果，随着病斑直径增大，污染范围增长并不明显。只有芒果病斑直径扩大至3cm时，污染范围扩大至病斑外延2cm，在病斑直径不大于2cm时，污染范围均在病斑外延1cm之内。番木瓜炭疽病斑从0.5cm扩大至3cm时，污染范围均在病斑外延1cm之内。两种水果相比较，炭疽菌的扩展范围基本一致，只有当病斑较大时（直径大于3cm），芒果病斑外延的污染范围要大于番木瓜。

表1 芒果不同病斑大小及病斑外延不同距离的炭疽菌菌落的检测结果

表2 番木瓜不同病斑大小及病斑外延不同距离的炭疽菌菌落的检测结果

3、结论

感染炭疽病的芒果及番木瓜中，炭疽菌已扩散一定范围，在直接食用或加工过程中，仅仅剔除腐烂斑处，并不能有效防止炭疽菌被食用，或进入加工流程对加工制品品质带来影响，所以建议当芒果腐烂斑不超过2cm时，剔除腐烂斑及其外延1cm，剩余部分可用；当病斑为2至3cm时，剔除病斑及其外延2cm，剩余部分可用。当番木瓜腐烂斑不超过3cm时，剔除腐烂斑及其外延1cm，剩余部分可用。

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国家农产品质量安全风险评估项目（GJFP2015014）