HPLC法在附子炮制中双酯型生物碱测定的应用价值

钱　瑛

·中药园地·

HPLC法在附子炮制中双酯型生物碱测定的应用价值

钱瑛

目的 探讨高效液相法（HPLC）在附子与其炮制品中双酯型生物碱含量测定的应用及效果。方法 生附子与其炮制品采用10%氨水浸润，乙醚超声提取的方法；色谱柱为Agilent Zorbax Ex tend-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为乙腈-0.2%冰醋酸（比例28∶72，pH为7.29），检测波长为235nm。结果 生附片中乌头碱类生物碱的含量以次乌头碱最高，新乌头碱次之，而乌头碱最低；附子的几种炮制品中，盐附子的毒性已经明显降低，而清水黑顺片、熟附片（干片蒸制）、熟附片（鲜片蒸制）中仅有微量的毒性成分，而炮附片中主要毒性成分的含量仍较高。结论 HPLC是一种较好的附子中乌头类生物碱的提取方法，对附子药材及其炮制品的质量控制和优化炮制工艺具有重要的意义。

附子 炮制品 双酯型生物碱 高效液相色谱法

附子属于毒性药材，其主要效用和毒性成分为二萜双酯类生物碱，包括乌头碱、中乌头碱、次乌头碱、塔拉乌头胺等成分［1］，然而其良好的功效与毒性并存，为减低其毒性，提高临床疗效，通常对附子进行炮制处理，常见炮制品包括黑顺片、盐附子、炮附片、刨附片、熟附片、黄附片等多种炮制品［2］。目前，对附子与其炮制品中双酯型生物碱含量的测定和质量评价方法尚未达到满意的效果。本资料采用高效液相法（HPLC）探讨附子与其炮制品中双酯型生物碱含量的测定，以了解附子炮制过程中双酯型生物碱变化，现报道如下。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂 Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司，包括真空脱气泵、四元泵、自动进样器、柱温箱和检测器）；AG-135精密电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；SK 5200H型超声波提取机（上海科导超声仪器有限公司）；R-205型旋转蒸发仪（上海申顺生物科技有限公司）；HH-2型数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；PHS-3C型pH值测定仪（上海康仪仪器有限公司）；乌头碱、新乌头碱和次乌头碱，对照品均为定量测定用，购自中国药品生物制品检定所，乙腈为色谱纯（美国Fisher公司），水为高纯水，其他试剂均为分析纯。生附片、熟附片（干片蒸制）、清水黑顺片、熟附片（鲜片蒸制）、盐附子、炮附片均购自嵊州市医药药材总公司。

1.2方法 （1）溶液制备：①生附子与其炮制品溶液制备：分别取生附子与其炮制品粉末适量，粉碎，过40目筛，分别取生附子粉末0.5g，炮制品2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10%氨水3 ml，湿润0.5h，再精密加入乙醚25ml，密塞，放置过夜；超声提取30min，滤纸过滤，再以25ml乙醚分3次冲洗药渣，过滤，合并滤液和洗液，置50℃水浴挥干乙醚，0.05%盐酸-甲醇溶液溶解残渣，并转移至10ml量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得样品溶液。②对照品溶液制备：分别精密称取乌头碱2.32 mg，新乌头碱2.16mg和次乌头碱对照品2.14mg，置于同一10 ml量瓶中，使用0.01%盐酸-甲醇溶液溶解并定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。（2）色谱条件［3］：色谱柱为Agilent Zorbax Ex tend-C18（4.6mm×250mm，5μm），柱温25℃；流动相为A和B两相梯度洗脱，A为乙腈，B为40mmol/L乙酸铵缓冲液（浓氨水pH为10.0）；乙腈-0.2%冰醋酸（比例28：72，pH为7.29），体积流量1ml /min；检测波长为235nm，进样量均为20μl。理论板数根据乌头碱峰计算≥3000。据此条件，供试品及对照品色谱分离度良好。（3）标准曲线制备：分别精密吸取生附子与其炮制品溶液、对照品溶液各1、2、4、6、8、10、12μl，注入液相色谱仪，分别测定峰面积积分值。分别以乌头碱、新乌头碱、次乌头碱对照品的进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），进行线性回归计算，得到回归方程。（4）精密度实验：精密吸取对照品溶液8μl，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，连续进样5次，记录各自的峰面积，并计算其平均加样回收率（RSD）值。（5）稳定性试验：精密吸取供试品溶液10μl，进样1次/2h，即分别在0、2、4、6、8h进样，测定双酯型生物碱的峰面积积分值，观察样品溶液在检测过程中待测成分的稳定性。（6）重复性试验：精密称取生附子样品粉末（过40目筛）2g，共取5份，制备供试品溶液并行HPLC测定，分别计算乌头碱、新乌头碱及次乌头碱的量。（7）加样回收率试验：精密称取生附片粉末（过40目筛）1g，共5份，每份用于一种生物碱的回收率测定，分别精密加入新乌头碱、乌头碱和次乌头碱对照品适量，制备成供试品溶液，在上述色谱条件下进行HPLC分析，根据测得量和加入量计算其回收率。（8）样品含量测定：分别精密称取待测样品粉末（过40目筛）2g，按上述方法配置成供试品溶液，注入液相色谱仪，进样10μl，记录色谱图，计算各供试品溶液中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量。

2　结果

2.1乌头碱、新乌头碱、次乌头碱线性回归方程 见表1。

表1　乌头碱、新乌头碱、次乌头碱线性回归方程

2.2精密度实验结果 乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的RSD分别为0.68%、0.72%、0.40%，表明仪器精密度良好。

2.3稳定性实验结果 乌头碱、新乌头碱、次乌头碱峰面积的RSD分别为0.65%、0.43%、0.76%，表明供试品溶液在8 h内稳定，可以满足测定需要。

2.4重复性试验结果 乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的平均质量分数分别为0.1750mg/g、0.5071mg/g和0.2285 mg/g，RSD分别为1.06%、1.57%和1.75%，表明测定方法的重复性较好。

2.5加样回收率试验结果 乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的RSD分别为97.35%（1.16%）、97.20%（1.36%）和97.70%（1.52%）。

2.6样品含量测定结果 见表2。

表2　生附片及5种炮制品的含量测定结果

3　讨论

在附子的双酯型生物碱分子结构中有一个乙酞基和一个苯甲酞基，此两个酯基是双酯型生物碱的主要毒性基团，在炮制加工湿热的状态下，双酯型生物碱酯键容易水解去掉一个酯基而转化成低毒的单酯型生物碱［4］，如苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和苯甲酰新乌头原碱，或继续水解去掉两个酯基转化为低毒的乌头原碱［5］。截至目前，我国有20多种关于附子的炮制方法，多为煎煮和蒸制的方式，以求达到扬其疗效、抑其毒性的目的。但是，由于生物碱既为药理成分又为毒性成分，因此炮制不足则附子中双酯型生物碱含量过高易导致用药中毒，炮制过度则双酯型生物碱完全水解，难于保证临床疗效［6］。因此，要求在附子的炮制过程中应建立能同时兼顾附子安全性和有效性的科学、量化的质量控制标准。由于附子在我国有比较广泛的分布，加之原药材规格及炮制方法差异较大，因此附子及其炮制品的质量存在一定的差异［7］。2005年版《中国药典》采用HPLC法对附子中的乌头碱含量进行了测算［8］，但这并不能全面而准确地反映附子药材中的药效成分。

在资料中，在200～400 nm范围内对乌头碱、新乌头碱、次乌头碱对照品溶液进行扫描，结果显示此3种溶液在235 nm处均有较好的吸收峰，因此选用235 nm作为本研究中各受试样品的检测波长。在提取方法的考察方面，则主要参照了文献的通用标准方法，即根据附子的性质，采用氨水浸润，乙醚超声法进行提取。另外结果显示，生附片中乌头碱类生物碱的含量以次乌头碱最高，新乌头碱次之，而乌头碱最低；附子的几种炮制品中，3种生物碱含量均较低或检测不到，充分说明了炮制减毒的目的。几种炮制品中，盐附子基本检测不到乌头碱、新乌头碱和次乌头碱；清水黑顺片、熟附片（干片蒸制）、熟附片（鲜片蒸制），仅能检测到少量的次乌头碱；炮附片除次乌头碱外，仍能检测到较高含量的新乌头碱。这说明生附片经过炮制后，盐附子的毒性已明显降低，而清水黑顺片、熟附片（干片蒸制）、熟附片（鲜片蒸制）中仅有微量的毒性成分，而炮附片中主要毒性成分的含量仍较高。HPLC使附子的3种双酯型生物碱均得到了较好的分离，可见HPLC法在附子与其炮制品中双酯型生物碱测定中具有方法简便快速、灵敏准确，实验结果稳定，重现性好，专属性强，且成本低、效率高的特点，RSD能达到定量的要求，是一种较好的附子中乌头类生物碱的提取方法，对附子药材及其炮制品的质量控制和优化炮制工艺具有重要的意义。

1 越皓,皮子凤,宋凤瑞,等.附子不同配伍药对中生物碱成分的电喷雾质谱分析.药学学报,2007,42（2）： 201～205.

2 吴超,赵翡翠,姜林.新疆准噶尔乌头及其炮制品的急性毒性和镇痛作用研究.新疆医科大学学报,2012,35（2）：197～201.

3 黄志芳,易进海,陈东安.制川乌HPLC特征图谱研究和6种酯型生物碱的含量测定.药物分析杂志,2011,31（2）：217～221.

4 孙兰,周海燕,赵润怀.HPLC法同时测定附子中6种单酯和双酯型生物碱.中草药,2009,40（1）：131～134.

5 刘文龙,刘志强,宋凤瑞,等.乌头类双酯型生物碱组分转化为单酯水解型及脂型生物碱组分的研究.高等学校化学学报,2011,32（3）：717～720.

6 陈东安,易进海,黄志芳.附片指纹图谱研究及6种酯型生物碱含量测定.中国中药杂志,2010,35（21）：2829～2833.

7 吴平丽,刘雯,卓超.应用高速逆流色谱技术从附子中分离制备苯甲酰新乌头原碱.中医药现代化,2009,11（2）：260～262.

8 国家药典委员会. 中华人民共和国药典： 2010 年版第一部.北京： 中国医药科技出版社,2010. 36～37.

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