外周血中性粒细胞凋亡相关蛋白质对SAP的诱导凋亡机制研究

秦斯敏　谭建荣　罗显克　王大东

外周血中性粒细胞凋亡相关蛋白质对SAP的诱导凋亡机制研究

秦斯敏谭建荣罗显克王大东

目的 探讨外周血中性粒细胞凋亡相关蛋白质及生长抑素在重症急性胰腺炎（SAP）时的诱导凋亡机制。方法 将90只SD大鼠编号，随机分为重症急性胰腺炎组（SAP组）和假手术组（SO组），每组45只，使用TUNEL荧光标记法、免疫组织化学法、RT-PCR法分别检测大鼠的外周血中性粒细胞凋亡情况、中性粒细胞survivin蛋白表达情况和中性粒细胞survivin mRNA的表达情况，分析比较两组的检测结果。结果 SAP组与SO组比较，24h、48h、72h三个时点中性粒细胞凋亡率呈现明显的下降（P＜0.05），SO组各时点中性粒细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）；SO组和SAP组大鼠外周血中性粒细胞survivin蛋白均有表达，SAP组大鼠24h、48h、72h三个时点表达明显高于SO组各相应时点（P＜0.05），SO组各时点中性粒细胞survivin 蛋白均有表达，差异无统计学意义（P＞0.05）；SO组和SAP组中性粒细胞survivin mRNA有表达，但SAP组24h、48h、72h组中性粒细胞survivin mRNA表达明显高于SO组（P＜0.05），SO组各时点中性粒细胞survivin蛋白均有表达，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 中性粒细胞的凋亡与SAP发展有密切关系，能遏制其进一步发展，改善患者预后。Survivin与中性粒细胞凋亡延迟有关，对其起到调控作用。

中性粒细胞 凋亡 重症急性胰腺炎

重症急性胰腺炎（SAP）是消化内科常见急性病，该病起病急，病情变化迅速，严重威胁患者生命和身心健康。外周血中性粒细胞激活与患者SAP的发展恶化有密切的联系，中性粒细胞凋亡的延缓与炎性反应持续及继发组织损伤有关。近年研究证实细胞凋亡参与了SAP病理生理过程［1］。中性粒细胞凋亡的延缓可能是胰腺炎引起的全身炎症反应及多脏器衰竭发展的机制之一。本文旨在研究外周血中性粒细胞凋亡相关蛋白质及生长抑素在SAP时的诱导凋亡机制。

1　材料与方法

1.1一般资料 选取清洁级、雌雄不限、体重300～350g的健康成年SD大鼠共90只，由广西医科大学实验动物中心提供。给所有大鼠进行编号，按照抛硬币法随机分为假手术组（SO组）和SAP组，各45只，其中SO组45只大鼠按照随机数字表法进一步随机分为24h、48h、72h三个时点，每个时点15只。SAP组45只大鼠进一步随机分为24h、48h、72h三个时点，各时点15只。所有大鼠分组后均衡性比较好，收集每个组存活大鼠的外周静脉血样，然后立即将大鼠处死并留取大鼠胰腺组织器官。

1.2方法 （1）SAP组：首先建立SAP模型，具体操作过程如下：取2%戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉大鼠，采用腹腔内注射麻醉方法待完全麻醉后，在大鼠腹壁消毒，然后使用外科手术刀在消毒腹壁正中切开，切口长度1.5～2.0cm。用无损伤显微手术镊子夹出十二指肠，寻找肝十二指肠韧带，翻开右缘可找到透明的胆总管。使用外科镊子小心分离一段大约4cm的胆总管备用，另使用无损伤显微手术血管夹阻断肝门下方的胆总管，随后顺着分离的胆总管向下，选择胆胰管汇入十二指肠距末端0.5cm处钝性剥离胆胰管约0.5cm，便于穿刺。在手术显微视野下使用24号小儿套管针逆行穿刺，待针插入约1.0cm后，立即拔出针芯，为防止药液倒流，可使用套上细乳胶管的显微血管钳夹置于穿刺点。将装有4%牛磺胆酸钠的微量输液泵的注射器连接到套管针的尾部。微量泵输入速度0.1ml/min、剂量1ml/kg，完成注射后在5min内拔出套管针，解除肝门部的阻断措施，为防止胆汁漏出可使用生物胶涂抹在针眼处，最后进行双层缝合腹壁。（2）SO组：接受类似SAP组的手术。切开1.5～2.0cm的切口，然后找到十二指肠，对胰腺进行翻动，不予任何措施，最后关闭腹腔。每组大鼠进行手术后予皮下注射0.9%氯化钠注射液2ml，防止大鼠在手术过程中丢失大量水分。所有大鼠手术后不禁水，控制室内温度20～25℃。使用TUNEL荧光标记法、免疫组织化学法、RT-PCR法分别检测大鼠的外周血中性粒细胞凋亡情况、中性粒细胞 survivin 蛋白表达情况和中性粒细胞survivin mRNA的表达情况。

1.3统计学方法 采用SPSS19.0软件。计数资料以（±s）表示。计量资料组间比较采用t检验，采用重复测量进行趋势分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1外周血中性粒细胞凋亡变化 见表1。

表1　外周血中性粒细胞凋亡变化的比较（%，（x±s）

2.2外周血中性粒细胞survivin蛋白表达的变化 见表2。

表2　外周血中性粒细胞survivin蛋白表达的变化比较（x±s）

2.3外周血中性粒细胞survivin mRNA表达的变化 见表3。

表3　外周血中性粒细胞survivin mRNA表达的变化比较（x±s）

3　讨论

造成SAP患者死亡的主要原因为多脏器器官功能衰竭，在众多脏器中，肺衰竭发生的几率是最高的，SAP并发肺损伤的发生率明显升高，可达50%～70%。中性粒细胞是体内数量最多的炎性白细胞，能明显影响机体的免疫系统，与机体免疫防卫有密切的关系，但其对机体本身正常组织也有非常严重的损伤。SAP引起的炎性反应比较强烈，其消退与否与外周血中性粒细胞的凋亡情况有重要的关系。

SAP患者炎性反应持续及组织损伤与外周血中性粒细胞凋亡的延缓有关。中性粒细胞通过凋亡延迟或抑制使得其存活时间明显延长，但也存在一个缺点，导致吞噬、杀伤等正常免疫功能丧失，仅能释放一部分氧自由基和蛋白水解酶及其他有害内容物，这均能促进炎症的加重和周围组织的损伤，从而导致SAP迁延和进一步恶化［2］。为了探索SAP对外周血中性粒细胞凋亡的影响及发生机制，作者通过对SAP组和SO组大鼠外周血中性粒细胞进行体外培养，连续孵育16h［3］，分别观察两组大鼠外周血中心粒细胞凋亡发生情况。本资料结果显示，SAP大鼠中性粒细胞体外培养16h自发性凋亡率明显低于假手术组，提示SAP大鼠外周血中性粒细胞的自发凋亡受到明显抑制，中性粒细胞寿命延长。另外，SO组大鼠外周血中性粒细胞survivin蛋白和mRNA表达较低或不表达。然而在SAP组大鼠中survivin蛋白和mRNA表达明显升高，提示SAP外周血中性粒细胞凋亡延迟的调控与survivin表达有密切的关系［4］。SAP组大鼠外周血中性粒细胞凋亡明显抑制了抑制蛋白survivin的高表达，提示可通过分子靶向方法抑制SAP组大鼠外周血中性粒细胞内的survivin的表达，从而控制和促进外周血中性粒细胞的凋亡程度，通过减少炎症介质的释放，可以有效阻遏SAP向SIRS、MODS等方向发展恶化，提高患者生存率［5，6］。

总之，外周血中性粒细胞凋亡与炎症介质有密切的关系，在SAP的迁延、恶化的过程中发挥了重要的作用，通过控制中性粒细胞的凋亡可有效控制SAP的病情，并且中性粒细胞中survivin的高度表达，说明其参与了中性粒细胞凋亡的延迟调控。

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6 Tamizhselvi R,Shrivastava P,Koh YH,et al. Preprotachykinin-Agene deletion regulates hydrogen sulfide induced toll-like receptor4 signaling pathway in cerulein-treated pancreatic acinar cells.Pancreas,2011, 40（3）：444～452.

Objective To investigate the mechanism of apoptosis induced by peripheral blood neutrophile granulocyte apoptosis related proteins and somatostatin in patients with severe acute pancreatitis. Method 90 SD rats were randomly divided into the severe acute pancreatitis group（SAP）and the sham operation group（SO），45 rats in each group，to detect the peripheral blood neutrophile granulocyte survivin expression，neutrophile granulocyte survivin protein expression and expression of neutrophil survivin mRNA by the Methods of TUNEL fl uorescence labeling method，immunohistochemical method and the RT-PCR method. Results SAP Group compared with SO group，24h，48h，72h three point neutrophil apoptosis rate decreased obviously（P＜0.05），the SO group at different time points of neutrophil apoptosis rate had no signifi cant difference（P＞0.05）；The peripheral blood neutrophils espressed survivin in two group，and the SAP group was higher than that in the SO group at the time of 24h，48h and 72h（P＜0.05），the peripheral blood neutrophils expressed survivin in SO group，there is no signifi cant difference（P>0.05），The peripheral blood neutrophils expressed survivin in two group，and the So group was higher than that in the SAP group at the time of 24h，48h and 72h（P<0.05），the peripheral blood neutrophils expressed survivin in SAP group，there is no signifi cant difference（P>0.05）. Conclusion There is a close relationship between neutrophil apoptosis and SAP development，to curb the further development，improve the prognosis of the patients. Survivin is plays a regulatory role in the delay of neutrophil apoptosis.

neutrophile granulocyte Apoptosis Severe acute pancreatitis

530001 广西壮族自治区民族医院消化内科