蛋氨酸脑啡肽对脐血来源CIK细胞作用的探索

李　玮　周金懿　李大鹏

蛋氨酸脑啡肽对脐血来源CIK细胞作用的探索

李玮周金懿李大鹏★

目的 尝试采用蛋氨酸脑啡肽（MENK）增强脐血来源的细胞因子诱导杀伤细胞（CIK）的增殖能力和肿瘤细胞杀伤能力，探索如何有效缩短细胞治疗周期并增强其疗效。方法 以原有细胞因子配方联合MENK作为观察组，以原有配方为对照组，通过细胞计数和细胞杀伤实验检测MENK对脐血CIK细胞的作用。结果 在细胞培养的第9天、第12天，观察组CIK细胞数量分别为（12.1±1.9）×109和（17.6±2.2）×109，高于同期对照组（9.4±1.3）×109和（10.7±1.7）×109；在肿瘤细胞杀伤试验中，观察组CIK的杀伤率在第9天、第12天分别为（49.82±1.86）%和（60.66±2.07）%，同期对照组杀伤率为（30.46±1.69）%和（50.46±1.94）%，观察组与对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 在细胞因子诱导脐血来源单个核细胞成为杀伤细胞的过程中，MENK具有促进杀伤细胞增殖，增强肿瘤细胞杀伤能力的作用；可使脐血来源CIK提前达到回输标准，缩短治疗周期。

蛋氨酸脑啡肽 细胞因子诱导的杀伤细胞 脐血

细胞因子诱导杀伤细胞（cytokine-induced killer cells，CIK）是目前国内应用比较广泛，疗效比较明确的过继性细胞免疫治疗。患者自体细胞一直是CIK的主要来源，但亦存在不足，脐血来源是有效的补充。本实验尝试用蛋氨酸脑啡肽（Methionie-enkphalin，MENK）进一步增强脐血来源CIK细胞的增殖能力和杀伤肿瘤细胞能力，为缩短治疗时间，扩大治疗范围，增强治疗效果做探索。

1　材料与方法

1.1材料 脐血来自苏州市脐血干细胞库，MENK来自美国Penta Biotech Inc.公司，抗CD3 单抗、IL-2、IL-1α和RPMI1640来自上海晶美生物工程有限公司。SKM-1细胞系来自作者所在实验室。CCK-8试剂盒来自武汉博士德生物公司。

1.2实验方法 （1）脐血单个核细胞分离及CIK细胞培养：将脐带血悬于Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液上，以2000rmp/min离心20min，将白膜层吸出后用RPMI1640清洗2次，调整细胞浓度至为1×105。培养液按组分别加入细胞因子配方，对照组为CD3mAb（20μg）+IL-1α（0.2μg）+IL-2（20万IU）；观察组为CD3mAb（20μg）+IL-1α（0.2μg）+IL-2（20万IU）+MENK（10-12mg/ml）。（2）CIK细胞增殖能力检测：对照组和观察组CIK细胞，每组设3个复孔，分别于培养的0d、3d、6d、9d、12d，取各组细胞每孔悬液少许，观察CIK细胞状况，在全自动五分类血液分析仪上进行细胞计数，检测细胞数量，以3孔平均值为当天该组细胞数量。（3）CIK细胞杀伤肿瘤活性检测：以培养9d、12d的CIK细胞为效应细胞，SKM-1细胞为靶细胞，按效/靶比（10：1）将观察组与对照组CIK细胞分别于SKM-1细胞混合。同时设SKM-1细胞孔，观察组与对照组CIK细胞孔和培养基空白对照孔。两组在各时间点均设3 个平行孔，置于细胞培养箱中12 h后，每孔加入10μlCCK-8，混匀，继续置于培养箱4h后用酶标仪测定每孔450 nm 波长处的OD值。细胞毒活性的计算方法：以3个平行孔的均值，按以下方法计算CIK细胞毒活性，用杀伤率表示。细胞毒活性=［1-（效靶细胞作用孔OD值-效应细胞孔OD值）］/靶细胞孔OD值×100%。

1.3统计学分析 采用SPSS10. 0统计软件分析。均值比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1MENK对脐血来源CIK细胞增殖力的作用 见表1。

表1　MENK对脐血来源CIK细胞数量影响［×109，（x±s）］

2.2MENK对脐血来源CIK细胞杀伤肿瘤活性的作用 见表2。

表2　MENK增强脐血来源CIK杀伤肿瘤细胞能力［%，（x±s）］

3　讨论

细胞因子诱导CIK是过继免疫细胞疗法的一种，目前国内应用较多，在全身静脉应用和体腔应用均有比较明确的治疗效果［1］。目前，仍然有不少患者需要进行免疫治疗，但因各种原因，不能采用自己的细胞。在这种情况下，脐带血细胞为一个可行的选择［2］。但是脐带血中单个核细胞数量较少［3］，如何更有效、更稳定地增殖杀伤细胞是一个亟待解决的技术问题。

MENK是脑啡肽（Enkephalin，ENK）的一种，在人体中分布广泛，除了具有镇痛作用和神经保护作用，还具备免疫调节和抗肿瘤作用［4］。MENK通过与免疫细胞表面的δ受体、μ受体结合，可激活免疫细胞并增加小鼠T细胞活性，其效果有剂量依赖性［5］。MENK对人体免疫细胞的具体作用也有一定的研究，结果显示在10-12mol/L浓度时，MENK对人体免疫细胞也有显著的增强活性作用［6］。国内也有MENK制剂直接应用于人体的临床研究，MENK明显改善了患者的免疫功能［7］。但是关于MENK在CIK领域的研究较欠缺的。

本资料结果显示，在细胞因子诱导脐血来源单个核细胞成为杀伤细胞的过程中，MENK具有促进CIK增殖，增强肿瘤细胞杀伤能力的作用。姚春等［7］研究证实脐血CIK细胞在抗白血病多药耐药方面有独特的优势，是缓解白血病细胞多药耐药的新途径之一，而MENK的作用增强了这一途径的可行性。MENK对于脐血来源单个核细胞作用的具体途径是否与之前的研究结果一致，还有待于进一步研究。

1 Zhong R,Teng J,Han B,et al. Dendritic cells combining with cytokineinduced killer cells synergize chemotherapy in patients with latestage non-small cell lung cancer. Cancer Immunol Immunother,2011,60（10）：1497～1502.

2 姚春,宋善俊.脐血CIK细胞对耐药白血病细胞体外杀伤效应及其机制的研究. 临床血液学杂志,2008,21（7）： 369～372.

3 Theilgaard-Monch K, Raaschou-Jensen K, Palm H, et al. Flow cytometric assessment of lymphocyte subsets,lymphoid progenitors,and hematopoietic stem cells in allogeneic stem cell grafts. J Exp Med,2002, 195（5）： 637～641.

4 Fengping Shan,Yanjie Xia. Functional modulation of the pathway between dendritic cells（DCs）and CD4 + T cell by the neuropeptide：Methionine enkephalin（MENK）. Peptides,2011,5（32）： 929～937.

5 Zagon Ian S,Donahue Renee N,Bonneau Robert H,et al. T lymphocyte proliferation is suppressed by the opioid growth factor（Met5）-enkephalin）opioid growth factor receptor axis： Implication for the treatment of autoimmune diseases. Immunobiology,2011,216（5）： 579～590.

6 Liu J,Chen W, Meng J, et al. Induction on differentiation and modulation of bone marrow progenitor of dendritic cell by methionine enkephalin（MENK）. Cancer Immunol Immunother,2012,61（10）： 1699～1711.

7 Wang DN,Meng JJ,Lv CL,et al. Immune system restore 0n terminal cancer patients by bio-peptide： Methionine Enkephalin（MEK）. Journal of microbiology,2008,28（5）： 39～41.

Objective To observe whether the cytotherapy period was cut or not，and the effect of proliferation and cytotoxicity of cytokine induced killer cells（CIK）derived from cord blood by application of Methionine Enkephalin（MENK）. Method All mononuclear cells from cord blood were divided into 2 groups，the control group cultivated with original cytokine formula，while the test group with the combination of MENK and the original. The effect was investigated by cell counting and cytotoxicity test. Result Both of the Results in proliferation and cytotoxicity test were signifi cantly higher in test group than in control group（P＜0.05）. The cells count showed（12.1±1.9）×109and（17.6±2.2）×109in test group at Day 9 and Day 12 respectively during cultivation，more than（9.4±1.3）×109and（10.7±1.7）×109in control. While the cytotoxicity rate of CIK revealed（49.82±1.86）% and（60.66±2.07）% in test group，comparing with（30.46±1.69）% and（50.46±1.94）% in control. Conclusion It was illustrated that the capability of proliferation and cytotoxicity promoted in CIK derived from mononuclear cells in cord blood by utilizing MENK and the cytotherapy period shortened as well.

Methionine enkephalin（MENK） Cytokine-induced killer cells（CIK） Cord blood

215006 苏州大学附属第一医院* 通讯作者