Ni(Ⅳ)配合物-鲁米诺流动注射化学发光体系测定人体尿液中皮质醇

代婷婷， 林华萍， 董 晓， 刁雅洁， 石红梅

(河北医科大学公共卫生学院，河北石家庄 050017)

皮质醇(Cortisol,Cor)又称氢化可的松，它是一种主要由肾上腺皮质束状带分泌产生的糖皮质激素，为一种应激激素，当机体受到感染、手术、麻醉、疼痛等各种刺激时，机体会产生应激反应，人体体液中的皮质醇含量可作为观察应激水平的指标。临床上常将皮质醇用作抗炎甾体类激素药物，其药理作用主要有抗炎、抗过敏和免疫抑制、抗核分裂等。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

IFFM-E型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈分析仪器有限责任公司)；1810-BC型石英自动双重纯水蒸馏器(江苏省金坛市白塔石英玻仪厂)；FA1104型电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)。

皮质醇标准储备液：准确称取0.0125 g皮质醇标准品(中国药品生物制品检定所)，溶于少量甲醇，用高纯水定容至25 mL，浓度为1.38×10-3mol·L-1。鲁米诺储备液：准确称取鲁米诺标准品(Sigma公司)0.8860 g，溶于7 mL 1.0 mol·L-1NaOH溶液中，用高纯水定容至250 mL，浓度为0.02 mol·L-1。Ni(Ⅳ)储备液：按文献方法[11]制备,储备液浓度依据配合物在波长410 nm处的吸光度值及其摩尔吸光系数(ε=1.06×105L·mol-1·cm-1)，由公式A=εbc计算得到，浓度为2.23×10-3mol·L-1。Ni(Ⅳ)配合物应用液用高纯水当天配制。实验用水为高纯水。

1.2 样品处理

1.2.1皮质醇注射液准确吸取皮质醇注射液(山西晋新双鹤药业有限责任公司，标示量5 mg·mL-1300 μL于100 mL容量瓶中，用高纯水定容，其有效成分浓度为15 μg·mL-1。

1.2.2尿样处理取5 mL空白尿样，加入PbO2搅拌10 min以去除尿酸、硫脲等，然后以10 000 r·min-1离心10 min，取上清液，用C18固相萃取柱净化后，取1 mL尿样稀释至100 mL，待测。

图1 流动注射化学发光流路示意图

用C18固相萃取柱分离富集待测尿液中皮质醇的含量步骤如下：(1)活化：取1.5 mL水和1.5 mL甲醇依次滴加到固相萃取柱上，滴干，重复一次，进行固相萃取柱的活化；(2)上样：取1 mL尿样处理液滴加到固相萃取柱上；(3)洗涤：2 mL水，1 mL 10%甲醇，2 mL 20%丙酮依次洗涤；(4)洗脱：1 mL甲醇溶液洗脱；(5)洗脱液于45 ℃下氮气吹干，溶于0.1 mL甲醇，用水定容于100 mL容量瓶中。

1.3 实验方法

实验流路如图1所示。Ni(Ⅳ)溶液首先与鲁米诺溶液经三通管混合均匀并充分反应，产生发光信号，待基线稳定后，通过进样阀将皮质醇溶液注入到Ni(Ⅳ)与鲁米诺的混合液流中，记录皮质醇对Ni(Ⅳ)-鲁米诺化学发光体系增敏的信号强度，以峰高定量。每次实验前后均需用高纯水将各流路的管道冲洗干净，待用。

2 结果与讨论

2.1 反应介质及其浓度的影响

2.1.1鲁米诺溶液浓度及pH的选择考察了鲁米诺溶液浓度在6.0×10-8～4.0×10-6mol·L-1(含0.01 mol·L-1NaOH)时皮质醇对体系化学发光强度的影响。结果如图2所示：随着鲁米诺浓度增大，皮质醇溶液对体系的增敏作用增强。当鲁米诺浓度达到6.0×10-7mol·L-1时，增敏作用最强。故选择鲁米诺的最佳浓度为6.0×10-7mol·L-1。

在NaOH溶液浓度为0.0001～0.02 mol·L-1范围内，考察了鲁米诺溶液的pH值对体系发光强度的影响。结果如图3所示：当鲁米诺溶液中NaOH溶液的浓度为0.01 mol·L-1，即溶液pH=12.0时，体系的灵敏度最高。

图2 鲁米诺溶液浓度对体系化学发光强度的影响

图3 鲁米诺溶液pH值对化学发光强度的影响

2.1.2Ni(Ⅳ)溶液浓度及pH的选择考察了Ni(Ⅳ)溶液浓度在1.0×10-8～2.0×10-5mol·L-1(含0.01 mol·L-1NaOH)范围内对该体系化学发光强度的影响(图4)。结果表明：Ni(Ⅳ)溶液的最佳浓度为4.0×10-6mol·L-1。同时考察了NaOH浓度在0.0001～0.03 mol·L-1范围内Ni(Ⅳ)溶液pH对体系发光强度的影响(图5)，随着Ni(Ⅳ)溶液pH的增高，体系的化学发光强度迅速增强。实验中发现Ni(Ⅳ)溶液pH在12.0～12.3范围时，化学发光信号虽增强明显，但基线噪声较大，信号不稳定。选择Ni(Ⅳ)溶液中NaOH的浓度为0.008 mol·L-1即溶液pH=11.9时，皮质醇对体系的增敏效果好且信噪比最好。

图4 Ni(Ⅳ)溶液浓度对发光强度的影响

图5 Ni(Ⅳ)溶液pH值对化学发光强度的影响

2.2 工作曲线、精密度与检出限

在优化条件下，对浓度为20 ng·mL-1的皮质醇标准溶液平行测定11次，根据每次测定的相对化学发光强度，计算得到其相对标准偏差(RSD)为0.56%。

2.3 样品分析

在优化的条件下，即鲁米诺浓度为6.0×10-7mol·L-1(含0.01 mol·L-1NaOH)，Ni(Ⅳ)浓度为4.0×10-6mol·L-1(含0.008 mol·L-1NaOH)时，对皮质醇注射液溶液、已处理稀释过的尿样(尿样取自三甲医院中患有肾上腺皮质功能减退症病人。早8点静脉滴入50 mg后2 h取其尿液，4 ℃保存，处理后测定)进行检测，根据标准曲线线性方程计算得到：注射液中皮质醇的含量为4.98 mg·mL-1；尿样中皮质醇的含量为8.36×10-7μg·mL-1。

2.4 回收率实验

取9份皮质醇注射液样品溶液，每份0.1 mL，分别定容至100 mL。在其中依次加入皮质醇标准品，制得低、中、高3个浓度水平的加标样品，每个浓度平行测定3次，计算得回收率，回收率在86.7%～107.5%之间。结果见表2。

表2 样品中皮质醇加标回收率测定(n=3)

2.5 化学发光反应机理探讨

实验证明，鲁米诺在pH=11左右有最佳发光效率。本研究采用Ni(Ⅳ)配合物做氧化剂，与鲁米诺组成新的化学发光体系，该体系中Ni(Ⅳ)配合物既可氧化鲁米诺产生发光(基线信号)，又可氧化皮质醇，且与皮质醇的氧化速度快于鲁米诺，使体系化学发光强度显著增强。Ni(Ⅳ)配合物的氧化能力与其浓度、pH在一定范围内呈正相关(浓度过大，配合物可能聚集；pH过高，配合物在溶液中的平衡可能改变，均可能使配合物氧化能力下降)。

从对该体系前期的研究[11]推断，可能的化学发光反应机理为：Ni(Ⅳ)和鲁米诺及皮质醇的反应均为自由基反应，且皮质醇与Ni(Ⅳ)反应较鲁米诺与Ni(Ⅳ)的反应快的多，反应过程中皮质醇产生的自由基转移给鲁米诺一部分，从而使鲁米诺自由基增多，发光体的量增多，使得体系的发光强度增强。

3 结论

建立了Ni(Ⅳ)配合物流动注射化学发光新体系测定皮质醇的新方法，对注射液和人体尿样中的皮质醇进行了测定，并对该体系可能的化学发光机理进行了分析。该方法简单、灵敏、快速，可用于实际样品中痕量皮质醇的测定。