基于碳点与硫黄素T之间的内滤光效应测定Cu(Ⅱ)

瞿 鹏， 武冠辉， 瞿昊宏， 宋凌霄， 田爱华， 徐茂田

(1.商丘师范学院化学化工学院，河南商丘 476001；2.郑州大学化学与分子工程学院，河南郑州 450052；3.商丘市第一高级中学，河南商丘 476001)

半导体量子点，如CdSe、CdTe 和PbTe等由于其独特的光学和生物化学性质而引起人们的极大关注。但是半导体量子点由于常使用镉等重金属离子，将在细胞成像时引起细胞死亡及环境污染。碳纳米材料，如碳纳米管、富勒烯、石墨烯等在生物传感和药物传递等方面具有重要的作用[1 - 3]。碳量子点(Carbon Dots,CDs)又称碳点，是继半导体量子点后的一种新型荧光纳米粒子。与传统的有机荧光分子相比，CDs具有相对高的荧光强度和光稳定性、无光闪烁、化学惰性及可调的激发和发射波长等优点。同时，与半导体量子点相比又具有如下优点：好的生物相容性、低毒和水溶性等。这种新型的纳米粒子可替代有毒的半导体量子点在生物成像和传感领域发挥重要的作用[4 - 6]。

细胞内的Cu(Ⅱ)在生理学和病理学方面起非常重要的作用。它是一系列酶的催化剂，如超氧化物歧化酶、细胞色素C氧化酶、酪氨酸酶等，细胞体内Cu(Ⅱ)的变化会导致一些严重的神经变性疾病[7,8]。因此，高灵敏、高选择性检测Cu(Ⅱ)具有重要的生物医学价值。

利用内滤光荧光传感体系可将吸光体的吸收信号转变为发光体的荧光信号，显著提高检测方法的灵敏度[9 - 11]。但是利用内滤效应构建荧光传感体系需要吸光体和发光体两种光活性物质，且吸光体的吸收光谱和发光体的激发或发射光谱有效重叠。而基于内滤效应的荧光传感还极少，需要进一步拓展。水热法合成CDs的文献已有报道，但是大都存在荧光量子产率较低的缺陷[4,12]。本文以柠檬酸为碳源，聚乙烯亚胺(BPEI)为钝化剂合成了高荧光量子产率的碳点(BPEI-CDs)。采用紫外-可见、荧光、红外光谱及原子力显微镜等对产物进行了表征。最后利用低毒性的CDs和硫磺素T(ThT)之间的内滤光效应测定了Cu(Ⅱ)。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UV-2300型紫外-可见-近红外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)；Cary Eclipse荧光分光光度计(美国，安捷伦科技有限公司)；Agilent AFM-5500原子力显微镜(美国，安捷伦科技有限公司)；Thermo Nicolet 360傅里叶变换红外光谱仪(美国，热电尼高力公司)；868型数字pH计(西班牙，orion公司)；SIGMA 3K15离心机(美国，Sigma公司)；MOTICE-36 T纯水仪(上海保尔水处理有限公司)。

柠檬酸(CA)和支链聚乙烯亚胺(BPEI，分子量为1 800 Da)(Alfa Aesar化学有限公司)，ThT(美国Sigma公司)，Na2HPO4·12H2O(天津市科密欧化学试剂有限公司)，KH2PO4(天津市基准化学试剂有限公司)。实验中所用试剂均为分析纯。实验用水是由MOTICE-36T纯水仪制备的纯水。

1.2 实验方法

1.2.1有机物碳化法合成BPEI-CDs在BPEI的存在下，通过一步法热解CA制得BPEI包裹的碳点(BPEI-CDs)。具体步骤为：在25 mL烧杯中，将0.5 g的BPEI和1.0 g的CA溶解在10 mL热水(温度约50 ℃)中，用合适功率的电热板加热，溶液的颜色逐渐从无色变成浅黄色。约50 min后，大部分水被蒸发，剩下浅黄色的凝胶。在凝胶烧焦之前，加入1 mL水，继续加热，该过程重复10次，最终凝胶的颜色为橙色。然后用水将总体积调至10 mL。将产物在13 000 r/min下离心30 min，取上清液进行分析。实验发现该方法制备的CDs浓度为0.11 g/mL，量子产率为39.8%(以硫酸奎宁为标准)。

1.2.2构建BPEI-CDs和ThT的荧光内滤光体系测定Cu(Ⅱ) 向ThT的5.0 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=4)中，加入适量的CDs，研究ThT荧光光谱的变化，然后再加入系列浓度的Cu(Ⅱ)，分析荧光强度的变化。设定激发波长为420 nm，发射波长为480 nm，激发和发射狭缝均为10 nm，扫描范围为400～600 nm。

2 结果和讨论

2.1 表征BPEI-CDs

图1 1.1×10-5 g/mL碳点在不同激发波长下的发射光谱

BPEI-CDs的紫外吸收光谱中，于355、245 nm处有两个明显的吸收峰(图略)。在荧光光谱图中，它的最大激发波长为355 nm时，最大发射波长为455 nm。发射波长随着激发波长而变化(图1)。另外，BPEI-CDs的荧光强度和pH值有关，在pH=4.0时荧光最强，但总体变化不大，在较宽的pH范围内呈现很好的荧光稳定性。

在红外图谱中BPEI-CDs几乎没有CA的特征吸收峰，但是却显示了BPEI的特征吸收峰，并且在1 711 cm-1处有酰胺键的一个特征的尖吸收峰(图2A)。说明CA几乎被完全碳化，而大量的BPEI通过酰胺键包裹在CDs的表面。原子力显微镜显示制备的碳点粒径分布均匀，且主要在3～6 nm之间(图2B)。

2.2 基于BPEI-CDs/ThT内滤光体系测定Cu(Ⅱ)

2.2.1构建BPEI-CDs和ThT的内滤光体系BPEI-CDs的发射光谱与ThT的激发和发射图谱都有很大程度的重叠(图3)。当BPEI-CDs和ThT彼此靠近时，ThT将吸收BPEI-CDs的荧光而使ThT的荧光显著增加。如图4，BPEI-CDs的荧光很强，而ThT很弱，当将BPEI-CDs加入到ThT中时，ThT的荧光显著增加并且最大发射波长从480 nm蓝移到465 nm，说明ThT吸收了BPEI-CDs发出的荧光。但将Cu(Ⅱ) 加入到BPEI-CDs的5.0 mmol/L PBS(pH=5)中时，BPEI-CDs的荧光减弱，而将Cu(Ⅱ)加到ThT的5.0 mmol/L PBS(pH=5)中时，ThT荧光无任何变化。说明Cu(Ⅱ)可猝灭BPEI-CDs的荧光但是对ThT荧光无影响。将Cu(Ⅱ)加到BPEI-CDs和ThT体系中，可以看到体系的荧光减弱，这是由于Cu(Ⅱ)对BPEI-CDs荧光的猝灭，导致ThT从BPEI-CDs吸收的光减少，进而发射强度降低。

2.2.2优化实验条件由于BPEI-CDs的荧光强度和pH有关。本文考察了pH值从2.0到10.0的(5.0 mmol/L)PBS对测定Cu(Ⅱ)的灵敏度的影响。当pH=5.0时，荧光降低值△F(△F=F0-F)最大。所以，该体系PBS的最优pH值是5.0。

图2 (A)CA、BPEI 和BPEI-CDs的红外图谱；(B)BPEI-CDs的原子力显微镜(AFM)图

随着BPEI-CDs浓度的增加，△F逐渐增大，并且在BPEI-CDs浓度为3.0×10-4g/mL时△F达到最大值，BPEI-CDs浓度继续升高△F反而下降。本实验中选择BPEI-CDs的浓度为3.0×10-4g/mL。

2.2.3在最优实验条件下测定Cu(Ⅱ) 在最优实验条件下，随着Cu(Ⅱ)浓度的增加，体系的荧光逐渐减弱(图5)。△F和Cu(Ⅱ)的浓度有良好的线性关系，线性方程为：△F=8.330+0.2721cCu(Ⅱ)，线性范围为5.0×10-8～5.0×10-5mol/L，线性相关系数R=0.9997，检测限(S/N=3)是1.0×10-8mol/L。

图3 BPEI-CDs 和ThT的荧光光谱图

图4 BPEI-CDs、ThT 与 Cu(Ⅱ)的之间的相互作用

2.2.4测定方法的可靠性考察了相同浓度下，Li+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Al3+、Fe2+、Fe3+、Ba2+、Zn2+、Ag+、Mn2+、Co2+、Cd2+、Hg2+和Pb2+对Cu(Ⅱ)测定的干扰。结果显示Cu(Ⅱ)所对应的△F要明显大于其他16种金属元素，见图6。说明该体系对测定Cu(Ⅱ)有很好的选择性。为了验证方法的实用性，我们进行了回收率实验，实验结果显示回收率在97.0%～102.5%之间，说明该方法用于样品测定是准确、可靠的。

图5 不同浓度Cu(Ⅱ)存在下BPEI-CDs/ThT体系的荧光光谱图；内插图是体系的荧光强度与Cu(Ⅱ)浓度的线性关系图

图6 BPEI-CDs/ThT体系测定Cu(Ⅱ)的选择性

3 结论

以柠檬酸为碳源、聚乙烯亚胺为钝化剂，用水热法合成了高荧光量子产率的碳点。另外，基于碳点和硫黄素T之间的内滤效应构建了测定Cu(Ⅱ)的荧光分析新体系，该体系对Cu(Ⅱ)测定具有很高的灵敏度和选择性。