栅藻延迟发光的初步研究*

付加雷，庞靖祥，聂晓艳，韩金祥1,△

(1. 山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东省中医药研究院，山东 济南 250014；3. 山东省医学科学院，山东 济南 250062)

1 引 言

与化学发光不同，所有生命系统均存在着超弱的光辐射，他们涉及的范围极为广泛：动物及其器官、组织、细胞等；植物及其根茎、花、果等；各种水藻；各种微生物，如细菌、酵母菌等。这种普遍存在于生物系统中的超弱光辐射被称为“生物光子辐射”(biophoton emission)。其典型强度为100个光子/(s·cm2)，光谱分布至少在200～800 nm内是连续的。生物光子辐射作为生命新陈代谢过程的一个产物，来自生物分子从高能态向低能态的跃迁[1]。大量的实验结果表明，生物光子辐射对生物系统内部的变化及外界环境的影响有高度的敏感性，因此，通过对生物光子辐射的探测和分析能够获得生物系统内部的微观信息，了解外界环境的微弱变化[2-4]。

栅藻是淡水中常见的浮游藻类，极喜在营养丰富的静水中繁殖，其中许多种类对有机污染物具有较强的耐性，可在水质评价中作为指示生物[5-6]。鉴于栅藻的以上特性，为了探讨栅藻生物光子辐射与生物学过程的关系，本研究采用YPMS-2生物光子测量仪对其生物光子辐射行为进行了初步探测，得到了一些有意义的结论。

2 材料和方法

2.1 供试生物

栅藻(Scenedesmus sp.) 购自中国科学院武汉水生生物研究所(编号FACHB-933)。

2.2 栅藻的培养

收到藻种后，首先将试管内藻液摇匀，在无菌操作下将藻液直接转入灭菌后的玻璃三角瓶(50 ml)内，然后将玻璃三角瓶瓶口封好，放置在光照培养箱中培养。培养温度25±1℃，光照条件2 000 Lux，时间设置12 h昼/12 h夜。培养20 d，藻种生长状态良好，生物量明显增多，在无菌条件下可再次转接，再次转接比例1∶5(藻液：培养基)，取长势良好的栅藻转接入盛有BG11培养基的500 ml锥形瓶中，培养一段时间后，测定藻悬液的生物光子辐射。

2.3 栅藻生长浓度的测定[7-8]

藻类的生物量测定是藻类生长、生理生化、生态等方面研究的必要手段，藻类生物量测定方法很多，通常的显微直接计数法，光密度(OD)测量法，叶绿素测量法，Counter 电子显微计数法等，各有优缺点。尽管到目前为止，计数细胞个体数仍然是最准确，最令人满意的方法之一，可以获得最基本的种群信息，但是直接计数法不但工作量大，不同种类间由此估算的生物量差异也较大。相比之下，光密度法操作简单，需要样品量少，能够实现快速测定。因此，为了准确、快速的测量栅藻生物量，本实验分别测定其细胞密度及吸光度(A)，并进行直线回归分析，得出回归方程：C=(A×11.995+0.1502) ×106个/ml(R2=0.9766)。按照此公式，只要测定出藻液的吸光度，就能计算出藻液浓度(C)。

2.4 栅藻延迟发光的测量

YPMS-2生物光子测量仪，购自荷兰米卢娜公司(Netherlands Meluna Research Company)。

将制备好的藻悬液混匀后倾入4 cm×1 cm×1 cm石英比色杯中，先用紫外分光光度计测其吸光系数，然后快速置于YPMS-2生物光子测量仪的样品暗室内，放置一定时间(约180 s)，以消除外界光源影响，使栅藻混悬液生物光子辐射达到自发状态，再立即用白LED光源激发，激发时间为10 s，测其延迟发光，一般测量时间为600 s。测量参数为：工作电压1250 V，测量时间600 s，间隔时间1 s。测定光子计数率—时间曲线、光子计数与栅藻浓度的关系以及培养基对栅藻延迟发光的影响。

2.5 数据处理分析

将测得的结果输入到OriginPro 9.1 软件中，分别对实验数据进行作图与非线性(双曲线)拟合，并分析处理。

3 结果与讨论

3.1 噪声、培养基与藻液延迟发光对比分析

提前2 h打开温湿度控制系统，室温恒定设置为20℃，湿度恒定设置为45%。打开YPMS-2生物光子测量仪，测量暗室的本底噪声，然后放入盛有3 ml液体培养基BG11的石英比色杯，测量培养基BG11自发与延迟发光，结果见图1。培养基BG11为含有无机盐NaNO3、K2HPO4、MgSO4、CaCl2、ZnSO4等的无菌水溶液。噪声的平均光子数为11.4/s，BG11自发的平均光子数为12.05/s，培养基BG11延迟发光从光子数60多个，1s后直接衰减至自发状态(平均光子数12.24/s)。无机盐水溶液培养基BG11的延迟发光几乎没有双曲性弛豫，呈现为指数衰减状态。

栅藻混悬液的延迟发光与培养基BG11延迟发光对比分析，见图2。培养基BG11延迟发光从光子数60多个，1s后直接衰减至自发状态(平均光子数12.24/s)，与本底噪声(平均光子数11.4/s)非常接近。藻悬液的延迟发光是从光子数6×104多个向下衰减，呈现双曲线弛豫；而培养基BG11的延迟发光从60多个光子衰减，呈现指数衰减。相对于藻悬液延迟发光而言，培养基延迟发光几乎可以忽略不计，即可以认为藻悬液的延迟发光就是藻体本身的延迟发光。

图2 栅藻与培养基BG11延迟发光对比分析

3.2 栅藻的延迟发光光子计数率——时间曲线

将栅藻悬液混匀后倾入石英比色杯中，置于YPMS-2生物光子测量仪的样品暗室内，放置一定时间(约180 s)，待栅藻悬液生物光子辐射达到自发状态后(自发状态的平均光子数约30/s)，立即用白LED光源激发栅藻，激发时间为10 s，测定其延迟发光，得到光子计数率——时间曲线，见图3。

图3 栅藻延迟发光光子计数——时间曲线

将双曲函数公式：

I(t)=I0/(1+t/τ)β

(1)

转换为公式：

y=a/(1+x/b)c

(2)

将公式(2)编辑入OriginPro 9.1 软件，将栅藻的混悬液延迟发光测得的数据，与理论表达式(2)做双曲线最佳拟合，其回归方程为：

y=586714/(1+t/0.4)^1.25，R2=0.9986

将测定的栅藻混悬液延迟发光数据，与双曲线函数(2)进行拟合，拟合关联度高达99.86%，拟合的三个参数a(I0)=586714，b(τ)=0.4，c(β)=1.25。双曲线衰减规律说明生物系统内的各个激发态分子之间是相互偶联的，它们可能通过生物系统内存在的电磁场互相联系，而这正是相干场的重要特征[9-10]。电磁辐射相干性：一部分自发的和光诱导的生物超弱发光的光子(量子)，起源于生物系统内一个高度相干的电磁场，这种相干电磁场很可能是活组织内通讯联络的基础[11-13]，而恰恰可能是生物光子扮演着生物体内一种新型通讯信使的角色[14]。用双曲线规律拟合栅藻的延迟发光数据曲线，拟合关联度高达99%以上，这一结果支持了Popp 的相干性理论，也符合延迟发光弛豫动力学过程不能用指数函数描述的特点[15]。

双曲函数公式(1)所含的三个参数I0、τ、β具有一定的物理意义：I0代表初始强度，它依赖于被测样品的性质，同时与光照条件有关；τ 是一个特征时间，只与样品自身的性质有关；β是一个指数因子，强烈控制弛豫的速率。这三个参数值定量地刻画了被测样品(在延迟发光意义上)的性质[4]。

3.3 栅藻藻液浓度对其延迟发光的影响

分别取生长旺盛的栅藻3 ml至5个14 ml离心管中，然后用液体培养基BG11分别稀释至4、5、6、7、8 ml，取其中3 ml入石英比色杯中，测量其吸光度以及延迟发光。根据测得的藻液吸光度A，依据公式C=(A×11.995+0.1502) ×106(个/ml)，计算每个稀释比例藻悬液的浓度(个/mL)，见表1。把不同浓度的藻悬液测得的延迟发光数据，分别与理论表达式(2)做双曲线最佳拟合，得出不同浓度藻悬液延迟发光曲线拟合参数，见表2。

由表1 可知，随着稀释比例的降低，不同浓度的藻悬液的吸光度也降低，其相应的藻悬液浓度也明显降低。

将盛有不同浓度藻悬液的石英比色杯，放入YPMS-2生物光子测量仪，测定其延迟发光。测得的不同浓度藻悬液数据利用OriginPro 9.1软件进行画图处理，由图4可知，单纯从延迟发光曲线来看，不同浓度藻悬液之间几乎没有明显的区别。将不同稀释比例的藻悬液(不同浓度的藻悬液)延迟发光数据，分别与双曲线函数(2)进行最佳拟合，拟合关联度都高达99.60%以上，其拟合后的参数，见表2。实测初始强度，即盛有藻悬液的石英比色杯，放入YPMS-2生物光子测量仪的样品暗室内，被白LED灯光源激发后，暗室快门打开，生物光子仪器初始记录的光子数。

图4 不同稀释比例的藻液延迟发光曲线对比

表2 不同浓度的藻液延迟发光曲线拟合参数对比

由表2可知，随着藻悬液浓度的降低，实测初始强度明显降低；a(I0)值也明显降低；c(β)值有升高趋势；b(τ)先降低后又微弱升高。(1)a(I0)应该代表理论初始强度，它依赖于被测样品的性质，同时与光照条件有关。在相同的白LED光源、相同时间激发下，不同浓度的藻悬液测得的延迟发光数据，经双曲线函数(2)进行拟合后，得出的理论上的初始强度a(I0)(即拟合出的双曲线的理论最高点)，一般比实际测得的初始强度高出许多。实测初始强度和理论初始强度都与藻悬液浓度呈正相关，即随着藻悬液浓度的降低，实测与理论初始强度也随之降低。(2) c(β)是一个指数因子，它强烈控制弛豫的速率。随着藻悬液浓度的降低，指数因子逐渐增大，即双曲线的弛豫速率升高。换而言之，随着藻悬液浓度的降低，其相应的延迟发光衰减变快。这一点从图4也可以看出，即随着藻悬液浓度越低，其延迟发光数据双曲线拐点越接近中心坐标轴原点。(3)b(τ)是一个特征时间，只与样品自身的性质有关，实验结果显示随着栅藻浓度的降低，延迟发光的特征时间有升高的趋势。生命系统相干性的另一表现是生物光子辐射的合作性[4]，其基本特征为：辐射寿命与原子数成反比，辐射强度与原子数的平方成正比，这就是所谓的“超辐射”。复杂的生命系统是由无数的小的子系统构成，整个复杂系统的辐射寿命与子系统的数量成反比，辐射强度与子系统的数量的平方成正比，我们的结果初步验证了该理论。

综上所述，单纯从延迟发光曲线来看，不同浓度藻悬液之间几乎没有明显的区别；但通过双曲函数拟合出来的三个参数(I0、τ、β)，就能很明显的把它们区别开，这三个参数携带着不同浓度栅藻和液体培养基的信息，即生物光子辐射携带着自身状态和外界状况的信息。这些实验数据的获得，为栅藻可作为液体环境的生物指示剂，奠定了一定的理论基础。

4 结论

(1)栅藻与培养基延迟发光对比以及栅藻在液体培养基中延迟发光分析，表明栅藻具有较强生物光子辐射能力。

(2)栅藻的光子计数率—时间曲线回归说明，用双曲线函数拟合，其拟合关联度高达99%以上，双曲线规律为生物光子辐射的相干理论提供了证据。

(3) 栅藻延迟发光的初始强度I0，随藻密度的增加而增强，两个计量之间呈显著正相关；随着藻液浓度的降低，指数因子β逐渐增大，即双曲线的弛豫速率升高，衰减变快；τ 是一个特征时间，与样品自身的性质有关。随着栅藻浓度的降低，延迟发光的特征时间有升高的趋势，这一结果再次验证了生物光子辐射相干性理论。

栅藻有较强的生物光子辐射能力，其延迟发光的双曲线规律为生物光子辐射的相干性理论提供了证据。双曲函数拟合出来的三个参数(I0、τ、β)有明显差别，其中τ 是一个特征时间，与样品自身的性质有关。随着栅藻浓度的降低，延迟发光的特征时间有升高的趋势，这一结果再次验证了生物光子辐射相干性理论。这三个参数携带着不同浓度栅藻和液体培养基的信息，即生物光子辐射携带着自身状态和外界状况的信息。这些实验数据的的获得，为栅藻可作为液体环境的生物指示剂，奠定了一定的理论基础。