高效液相色谱法测定水产品中甲基睾酮残留量的不确定度评定

张惠峰，綦天华

（长春市水产品质量安全检测中心，吉林 长春 130033）

高效液相色谱法测定水产品中甲基睾酮残留量的不确定度评定

张惠峰1，綦天华2

（长春市水产品质量安全检测中心，吉林 长春 130033）

依据JJF1059—2012 《测量不确定度评定与表示》和CNAS-GL-06《化学分析中不确定度的评估指南》，建立了高效液相色谱法测定水产品中甲基睾酮残留的不确定度评定的数学模型。对测量过程中各不确定度来源进行分析，计算各不确定度分量，最后给出合成标准不确定度和扩展不确定度，评定结果表明：不确定度主要来源于测试过程的随机效应、曲线校准和样品处理过程。

不确定度；甲基睾酮；高效液相色谱法；水产品

甲基睾酮又名甲睾酮、甲基睾丸酮、甲基睾丸素。是一种合成类固醇，属于蛋白同化激素，具有雄性和蛋白同化双重作用［1-2］。曾作为一种性激素和强壮剂被广泛用于水产养殖业中，如罗非鱼、鲤鱼、鳗鱼、鳝鱼、鳟鱼、甲鱼等。甲基睾酮代谢时间长，对人类的危害是慢性、远期和积累性的，主要干扰体内自然激素的平衡，使生理功能紊乱，并且可干扰肝内毛细胆管的排泄功能［3］。目前，高效液相色谱法已广泛用于水产品中甲基睾酮的定量检测，我国已规定在水产品中甲基睾酮为不得检出，因此对甲基睾酮残留量的监测已成为一项重要的常规检测项目［4］。

测量不确定度对于测量结果之间的比较、数据解释、检测程序中需要注意的因素、方法的确认等都有着十分重要的意义，因此在水产品安全检测等各领域越来越受到重视。学者曾研究了水产品中孔雀石绿［5-6］、多氯联苯［7］、硝基呋喃类代谢物［8］、挥发性盐基氮［9］、磺胺类药物［10］、喹诺酮类药物［11］等残留量检测方法［12-17］的不确定度评定，目前国内尚无甲基睾酮残留量测定不确定度评定的相关报道。本实验依据不确定度的评定的基本方法和程序［18-22］，以高效液相色谱法［23］为例，探讨水产品中甲基睾酮残留测定的不确定度的来源、分析评定、合成及结果表述。建立该方法的测量不确定度模型，分析影响测定结果的各主要分量，在实际操作中可用于指导分析人员进行重点控制，从而提高测定结果的准确性和可靠性。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

水产品（鳕鱼、鲤鱼、鳙鱼） 长春东北亚物流有限公司；甲基睾酮标准品（纯度99%） 德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇（色谱纯） 美国Fisher公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

1200高效液相色谱仪（配紫外检测器和自动进样器） 美国Agilent公司；XS205分析天平 瑞士Mettler公司；TE212-L电子天平 德国Sartorius公司；TDL-40B台式离心机 上海安亭科学仪器厂；R-215旋转蒸发仪 瑞士Büchi公司；Research plus可调量程移液器 德国Eppendorf公司。

1.3方法

1.3.1标准溶液的配制

标准储备液：精密称取甲基睾酮标准品0.010 0 g，用甲醇溶解，定容于500 mL容量瓶中，质量浓度为20 μg/mL。

标准中间液：准确量取上述标准储备液5 mL用甲醇稀释并定容至10 mL容量瓶，质量浓度为10 μg/mL。

标准工作液：用甲醇将标准中间液逐级稀释成质量浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.50、10.00、5.001.00、 μg/mL的标准工作液，供高效液相色谱分析。

1.3.2样品提取和净化

样品处理采用SC/T 3029—2006《水产品中甲基睾酮残留量的测定：液相色谱法》［23］进行，方法检出限10 μg/kg。，具体步骤如下：精确称取5.00 g经充分匀浆的鱼肉于50 mL玻璃离心管中，加入20 mL乙醚，旋涡混匀15 min，4 000 r/min离心10 min，所得上清液移至鸡心瓶；残渣加入15 mL乙醚再提取一次，合并上清液至鸡心瓶，在40 ℃左右水浴中减压旋转蒸发至干，残渣中加入5 mL甲醇溶液（4∶1）清洗，转移至10 mL具塞玻璃离心管中。加入4 mL石油醚至离心管中，加塞旋涡混匀2 min，4 000 r/min离心10 min，弃去上层石油醚层；下层加入4 mL石油醚重复操作一次。下层甲醇溶液在40 ℃左右水浴中减压旋转蒸发至0.5 mL，转移至10 mL具塞离心管。加入2 mL水清洗瓶壁，合并水溶液，加入4 mL乙醚，旋涡混匀2 min，4 000 r/min离心10 min，取上层乙醚层于鸡心瓶中；下层用4 mL乙醚再提取一次，合并上层至鸡心瓶中。在40 ℃左右水浴中减压旋转蒸发至干，1 mL流动相定容，经聚四氟乙烯膜过滤，待测。

1.3.3色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（72∶28 ，V/V）；流速：0.8 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2　结果与分析

2.1建立数学模型

式中：w为水产样品中药物残留量/（μg/kg）；Cx为提取样液中药物质量浓度/（μg/mL）；Vx为提取样液定容体积/mL；m为样品质量/g；为回收率校正因子。

2.2不确定度的来源分析

2.2.1曲线校准过程引入的不确定度

包括标准工作曲线拟合所引入的不确定度、标准溶液稀释过程所引入的不确定度。其中标准溶液稀释过程中的不确定度由标准品的不确定度、移液管和容量瓶体积的不确定度、校准和使用温度不同导致的不确定度组成。

2.2.2样品质量引入的不确定度

由天平的最大允许误差构成。

2.2.3样品加标过程引入的不确定度

由目标样品在制备过程中由于加标的体积的不确定度构成，非加标样品可不考虑该部分。

2.2.4样品前处理过程引入的不确定度

测试样品的制备过程非常复杂，每一步操作均会引入不确定度，采用检测方法确认中的回收率对制样过程中引入的不确定度进行评定。

2.2.5体积引入的不确定度

由定容体积和进样体积的不确定度构成。

2.2.6仪器引入的不确定度

由液相色谱仪引入的不确定度。

2.2.7测试过程随机效应导致的不确定度

包括样品的均匀性和代表性、天平的重复性、体积刻度充满的重复性、进样的重复性、和仪器积分面积重复性等因素引起的不确定度。

2.3不确定度的分量评定

根据不确定度的来源分别对校准过程、样品质量、样品加标、样品处理、液相色谱测试及随机过程中引入的不确定度进行单个分量的量化评定。

2.3.1曲线校准过程引入的不确定度

2.3.1.1标准溶液配制引入的不确定度

原始标准物质引入的不确定度：标准物质给uprel出的扩展不确定度，属于正态分布，置信概率p=95%，包含因子k=2，为B类评定，up=0.5/2=0.25uprel=up/ p=0.25/99.0=0.002 5根据上述计算公式可求得标准物质的相对不确定度为0.002 5。

标准物质称量引入不确定度umxrel标准物质的称量质量为0.010 0 g，使用XS205电子天平称量，该天平经计量检定为Ⅰ天平，检定分度值为0.1 mg，依据JJG 1036—2008 《电子天平检定规程》［24］称量范围0≤m≤5 g时最大允许误差为±0.05 mg（0.5e），按照均匀分布计算，为B类评定。则其不确定度为相对标准不确定度为：umxrel=umx/mx=0.002 9。

标准储备溶液定容引入的不确定度uVsrel：按照JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》［25］，20 ℃时，500 mL容量瓶（A级）最大允许误差为±0.25，满足均匀分布，k=，为B类评定。由量器校准引入的不确定度为：uml=0.25/=0.144 mL，相对不确定度为umlrel=uml/m=0.144/500=0.000 3容量瓶在20 ℃条件下检定校准，因溶剂体积受温度变化的影响远大于各量器自身，因此仅考虑前者。标准储备液在（20±2）℃条件下配制，溶剂为甲醇，20 ℃时甲醇体积膨胀系数为α=0.2×10-3℃-1。按照均匀分布，则因温度变化引起溶剂体积改变的标准不确定度为uV=ΔV/，ΔV=V×ΔT×α，温度对体积影响引入的标准不确定度为1.2/=0.692，相对标准不确定度为uTrel=0.692/500=0.001 4。标储溶液定容过程相对不确定度合成为

标准溶液稀释引入的不确定度uVWrel，由量器校准和环境温度变化引起溶剂体积改变引入不确定度组成：（1）量器校准引入的相对不确定度uVWlrel

标液稀释过程中所使用量器见表1，参考JJG196—2006［25］和JJG 646—2006《移液器检定规程》［26］要求，依据相应最大允许误差，计算得每次定容量器校准的相对标准不确定度见表1，具体步骤同umlrel，则合成相对不确定度为：

表1　量器校准引入的不确定度Table 1 Uncertainties caused by container calibration

（2）环境温度变化引起溶剂体积改变引入的相对标准不确定度uV2rel

标液稀释过程中所用溶剂为甲醇，实验温度为（2 0±2）℃，计算过程同uTrel，各相对标准不确定度见表2，则合成相对不确定度为：

标准溶液配制过程中由原始标物、标物称量、标储定容、标液稀释引入的相对不确定度合成为：

表2　环境温度变化引入的不确定度Table 2 Uncertainties caused by environmental temperature changes

2.3.1.2标准工作曲线拟合引入的不确定度u（xpred）rel

配制甲基睾酮的7 个不同质量浓度标准溶液（0.05、0.1、0.5、1、2、5、10 μg/mL），对标准溶液和被测溶液分别用液相色谱测试1 次，得到相应的峰面积A，采用最小二乘法拟合，得到标准工作曲线的线性回归方程Y=aX+b（b为截距，a为斜率）和方程的线性相关系数如表3所示。

表3　甲基睾酮标准曲线测定结果Table 3 Standard curves of methyltestosterone

依据校准数据，结合由用来导出校准曲线的软件提供的出残余标准误差s，由y的（随机）变化性，预估计值xpred的不确定度可计算得，由标准工作曲线拟合引入的相对不确定度为0.000 02，为A类评定。

式中：s为由软件给出的残余标准误差；xpred为被测溶液的估计值，用被测溶液的平均值表示；为绘制工作曲线的全部x值的平均值；p为对被测溶液质量浓度进行的测定次数；n为对标准溶液质量浓度进行测定的次数。

2.3.1.3曲线校准过程引入的不确定度u（cal）rel

曲线校准过程中由标准溶液配制和标准工作曲线拟合引入的相对不确定度合成为：

2.3.2样品质量引入的不确定度umrel

样品的称量质量为5.00 g，使用赛多利斯TE212-L电子天平称量，该天平经计量检定为Ⅲ级天平，依据检定证书和JJG 1036—2008《电子天平检定规程》［24］，该天平检定分度值为0.1 g，称量范围0.2 g≤m≤5 g时最大允许误差为按照均匀分布计算，为B相对标准不确定度为：

2.3.3样品加标过程引入的不确定度ualrel

目标样品用10～1 000 μL移液器向鳕鱼空白基质样品中加入1 000 μL质量浓度为4 μg/mL的标准工作液制备而成，实验温度为（20±2）℃，计算过程同uVsrel，为B类评定。由此产生的标准不确定度为ual=5.773 7 μL，相对不确定度为ualrel=5.773 7/1 000=0.005 8。

样品前处理过程中产生的不确定度属于A类评定，采用回收率6 个平行样品（鳕鱼、鲤鱼、鳙鱼样品各2份）添加回收率的相关数据进行计算。回收率分别为 79.3%、77.6%、79.7%、75.7%、76.3%、75.5%。根据回收率平均值（ec）的标准差的相对标准不确定度采用平均值的相对标准偏差：

平行样品提取样液中药物质量浓度分别为3.39、3.18 μg/mL，提取样液定容体积1.00 mL，样品质量5.00 g，检测结果分别为678、636 μg/kg，平均值回收率校正因子校正，样品中甲基睾酮残留量检测结果分别为877、823 μg/kg，平均值

2.3.5由定容体积引起的不确定度uVrel

样品使用1 mL移液器加入1.0 mL流动相定容。流动相的主要组成为甲醇，实验在（20±2）℃条件下进行，为B类评定，计算过程同uVsrel，样品定容引人的相对不确定度为uVrel=0.006 0。

2.3.6由液相色谱仪引入的不确定度uuvwrel

根据仪器检定证书，整机定量重复性RSD6=0.12%，为B类评定。

测试过程随机效应通过样品的重复测定进行不确定度评定，属于A类评定。测定样品中甲基睾酮残留量，检测结果分别为678、636 μg/kg，平均值按照矩形分布处理，则测试过程随机效应导致的标准不确定度和相对标准不确定度分别为：

2.4合成不确定度及扩展

合成不确定度采用方和根法，即将各个标准不确定度分量平方后求其和再开根。因不确定度分量较多且其大小也比较接近时，估计为正态分布，选95%的包含概率时，包含因子取k=2，对不确定度进行扩展。

2.4.1合成相对标准不确定度urel

将测试过程中由曲线校准、称量质量、样品加标、定容体积、样品前处理过程、液相色谱仪、随机效应引入的相对不确定度合成为：w=（850±79）μg/kg；k=2。

2.4.2合成相对扩展不确定度Urel

在95%置信水平下，k=2时，试样甲基睾酮含量测定的相对扩展不确定度为：Urel=k×urel由实验数据的平均值计算试样中甲基睾酮含量w=（850±79）μg/kg，故其标准不确定度为扩展标准不确定度为U=k×u=0.093 0×850=79.0 μg/kg。

2.5测量结果报告

目标样品甲基睾酮含量测试结果表示为w=（850±79）μg/kg；k=2。无论是给出扩展不确定度还是标准不确定度，通常不确定度的有效数字不多于两位。测试结果应根据所给出的不确定度进行修约。

2.6各影响因素的不确定结果

各影响因素的不确定结果见表4。

表4　各影响因素的不确定度结果Table 4 Uncertainty evaluation for the determination

3　结 论

对实验结果进行不确定度评定时要考虑试验过程的每个环节，但不是所有不确定度的来源都有评估其不确定度所需的数据，且这些来源也不一定是独立的，如抽样方法、样品的均一性、样品的储存条件、样品的影响、空白修正、方法的偏差等，可依据实际情况筛选进行取舍。当被测量值在法规给出规定限值时，应当关注限值中是否给出不确定度的允许量，并在评价符合性时依据不同情况考虑分析结果的不确定度。根据t检验判断平均回收率与1.0有显著性差异，检测结果必须经过校正。通过对试验过程中各相对不确定度分量分析可知，试验过程中不确定度的主要来源为测试过程的随机效应，其次为标准校准过程，以及样品的处理过程。因此建议在实际操作过程中增加平行样的测定次数，不断熟悉样品处理过程以提高回收率，并且应尽量减少标准溶液稀释倍数。此外，实验室建立良好的实验环境条件、使用高精密度和稳定性的仪器设备并定期进行检定/校准，使用高纯度的有证标准物质、开展新检测项目时进行方法确认并选用性能参数较好的检测方法等都将有利于提高检测结果的准确性和可靠性。

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Uncertainty Evaluation for Determination of Methyltestosterone Residue in Aquatic Products by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Huifeng1， QI Tianhua2
（Changchun Inspection Center for Aquatic Products Safety and Quality， Changchun 130033， China）

According to the basic methods for uncertainty evaluation from Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement （JJF1059-2012） and Guidance on Evaluating the Uncertainty in Chemical Analysis （CNAS-GL-06） a mathematical model of uncertainty evaluation for the determination of methyltestosterone residue in aquatic products by HPLC was established. The sources of determination uncertainty were analyzed and each component of uncertainty was quantified. The combined standard uncertainty and expanded uncertainty were finally obtained. The major uncertainty sources were the random effects in testing process， curve calibration and sample pretreatment.

uncertainty； methyltestosterone ； high performance liquid chromatography （HPLC）； aquatic products

TS207.3

A

1002-6630（2015）18-0199-05

10.7506/spkx1002-6630-201518037

2014-12-19

长春市水产品质量安全风险评估专项（2014-1485）

张惠峰（1982—），女，副研究员，硕士，主要从事水产品质量安全及水环境研究。 E-mail：xiaoqiutong@126.com