同步荧光法结合主成分分析法鉴别橙汁品质

张晓丽，毛立新，范三红*

（山西大学生命科学学院，山西 太原 030006）

同步荧光法结合主成分分析法鉴别橙汁品质

张晓丽，毛立新，范三红*

（山西大学生命科学学院，山西 太原 030006）

对鲜榨橙汁与市售某品牌橙汁进行同步荧光扫描得到其三维荧光光谱，并从光谱中提取出3 组特征峰。然后结合其中荧光物质的特性，得知这3 组特征峰对应物质分别为VB2、VB6和黄酮类物质。同时，采用主成分分析法结合于激发波长240～640 nm、发射波长与激发波长差为30 nm条件下扫描而得的同步荧光光谱数据对所有橙汁样品进行聚类并识别，效果良好。结果表明：将荧光光谱技术与光谱模式识别方法相结合，可为橙汁品质鉴别提供有力技术支持。

橙汁；同步荧光法；主成分分析

随着社会生活及人们营养认知水平的提高。消费者逐渐倾向于饮用鲜榨果汁或者原果汁。橙汁即为原果汁添加量100%不含添加剂的饮品，由于其营养丰富口味大众已成为果汁销量中最大的一类。因此不法商贩为牟取暴利有意偷工减料、掺伪掺杂，不仅侵害消费者权益且有损行业形象。鉴于此，食品工作者应积极寻找鉴别此类掺假的有效分析方法。使橙汁产业健康发展。橙汁制伪一般为以糖、酸、香精、色素、水加以调配成完全不含原果汁的“三精水”，或是在稀释果汁中掺入糖、有机酸冒充原果汁或鲜榨橙汁［1-2］。

现有橙汁鉴伪分析检测方法主要是感官评定法，此法最简单，但过度依赖评定人员的经验且主观性强；其次是标样比较法，国外有荷兰食品研究检察所31 项果汁分析内容及德国水果原汁基因重组链激酶值检测方法，此二者客观准确但所需检测项目过多，实际应用中较难推广。我国GB/T 16771—1997《橙、柑、橘汁及其饮料中果汁含量的测定》只有6 项指标，与彼相比又失之简单、准确性降低。且有研究指出，此6 项指标与橙汁含量相关性均未达到显著相关水平。在上有基础上又发展出“主要成分检测法”，以原橙汁中主要成分作为原汁含量依据结合现代分析技术进行判别。如采用毛细管等速电泳及真空紫外检测技术，检测柑橘汁样品中的阴离子，获得特征区带与标准样对照，判断是否掺假。利用呈香物质中各自特征成分不同的特点利用新型的传感器阵列技术，分析柑橘汁49 个样品的香气成分，建立数据库用于柑橘汁分类。结合高效液相色谱和气相色谱技术，可用于检测掺假情况。荧光检测法正是以此为原理，借助样品中荧光物质表现出的性质结合化学计量学方法及计算机软件对待测样品进行鉴伪。上述方法有些比同步荧光法准确但是操作繁琐成本高，有些比同步荧光法简便，但是覆盖信息可能不太全面。同步荧光法与其相比，快速、安全、无损且是针对样品整体进行操作，可反映样品中所有荧光物质的信息［2-8］。

同步荧光法即同时对激发和发射2 个单色器波长进行扫描，由测得的荧光强度信号与对应的波长得到同步荧光光谱图，本实验采用同步荧光法中的恒波长同步荧光法。与常规荧光法相比，同步荧光分析法具有简化谱图、提高选择性、减少散射干扰等特点，尤其适合多组分混合物的分析测定。而且结合主成分分析（principal component analysis，PCA）对其数据加以解释弥补其相对于色谱法选择性差的缺点。而且同步荧光法现已用在诸多食品的不同方面监测如：对五粮液、茅台醇和高沟进行荧光光谱检测，可准确将五粮液与其他白酒区分开来；建立了红河州不同地区野山茶的荧光指纹图谱；对食用调和油中掺入不同比例地沟油的样品分析其三维荧光光谱图中VE产生的荧光峰的特征可作为调和油中是否掺入地沟油的判据等［9-20］。

PCA是指把原有数据中较多的指标简化为少数几个既不相关又能综合反映原来多指标所提供信息主要部分的新的综合指标。这些新的综合指标称为原来指标的主成分，并且按照其所含原数据信息的大小依次称为第1主成分、第2主成分。从而利用这些主成分对原有数据进行直观表达或者进行分类、回归等分析：如梁曼等［20］利用PCA分析经预处理后的不同品种藻类的光谱数据，结果显示几种藻类样品在主成分特征空间中独立分布，所以可借此对藻类进行鉴别；王春艳等［18］利用PCA对2 套不同层次原油相关样品进行分类识别，结果在载荷图中可得出不同相关样品在油源上的相似程度，可实现溢油样品准确识别；国外学者利用PCA结合浅表面荧光法以肌肉中固有荧光物质表现出的光谱特征可快速鉴别鱼的新鲜程度［19-22］。

因此，先前学者有利用同步荧光法所得图谱特征对检测样品进行鉴别分析，也有学者利用PCA结合其他荧光光谱法对多种样品进行判别鉴定分析。此次利用PCA结合同步荧光法对橙汁品质进行鉴别，为橙汁鉴伪提供又一行之有效的简便方法，且增加了同步荧光法的用途。

此次工作对6 种不同原料所榨橙汁和市售某品牌橙汁进行同步荧光光谱扫描，并通过绘图软件合成同步荧光指纹图谱和二维图谱，通过分析图谱及其提供的特征参数并结合PCA实现了对不同来源橙汁的快速鉴别。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

赣南橙、脐橙、丑柑、金橘、蜜橙、芦柑和某品牌橙汁都购买于太原市沃尔玛超市。前6 种橙果都冻藏于冰箱中，某品牌橙汁避光贮藏于0～4 ℃的冰箱中，测定时提前取出待橙果解冻后进行实验。

1.2仪器与设备

RF-530荧光检测计 日本岛津公司；N3000色谱工作站 浙江大学智能信息研究所；AeTGL-16G台式离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3方法

1.3.1样品制备

橙果用流动冷水解冻，去皮去籽然后以榨汁机处理再用4 层纱布过滤，滤液离心处理取上清液进行梯度稀释。离心条件：3 000 r/min，15min。

橙汁质量分数较大、颜色偏深，为避免荧光检测中出现荧光淬灭及拉曼散射等现象。采用稀释的梯度质量分数橙汁进行同步荧光扫描，以期获得峰形良好、荧光强度适当的稀释质量分数及扫描波长差。最终采用5%的稀释液。

PCA中赣南橙、脐橙、蜜橙都取4 个批次，分别编号为G1～G4、Q1～Q4、M1～M4，丑柑取3 个批次，金橘一个批次，编号如上。

1.3.2同步荧光光谱采集

灯源：75 W氙灯；单色器：闪耀式全息光栅；刻线：900条/mm；激发波长范围：240～640 nm；波长精度：±1.5 nm；分辨率：0.1 m；灵敏度：100；仪器灵敏度：H；输出信号衰减：16；扫描速率：600 nm/min。仪器经过改装，将激发单色仪和发射单色仪旋钮连至2 台步进电机，步进电机采用数控软件自动控制电机运转速率和停留位置，实现自动扫描。在不同激发波长和不同波长间隔（10～170 nm）范围内同时进行扫描，每间隔10 nm在N3000色谱工作站进行1 次数据采集。

1.4统计分析

使用Origin 7.0软件，以波长间隔激发和波长为横、纵坐标轴，结合相对荧光强度绘制同步荧光等高线指纹光谱图。使用Unscrambler 9.8软件绘制二维图谱并进行统计分析。

2　结果与分析

2.1不同品种橙汁识别

2.1.1稀释质量分数及扫描波长差确定

以脐橙汁5%的稀释液及原液的同步荧光光谱二维图即对应图1A和1B为例分析：图1A在波长差为30 nm时峰形完整，强度适宜，波长差为10、20 nm时由于程序设置原因出现了平头；波长差大于30 nm时，荧光强度都很低且相互堆叠不能确定峰位置。而图1B即橙汁原液在波长间隔为10、20、30 nm时都出现平头峰，40 nm时峰形良好但是强度低（100），综合考虑对于脐橙汁选用5%的稀释液及在波长差为30 nm时进行后续实验。对剩余的其他6 种原料进行同样操作，都有相似规律。故对所有原料都采用5%稀释液及波长差30 nm进行实验。

图1 2 种不同质量分数脐橙汁同步荧光光谱图Fig.1 Synchronous fl uorescence spectra of different concentrations of navel orange juice

图1A即5%脐橙汁同步荧光光谱图中，在约280、380、460 nm波长处各有一个荧光峰。

图 22 VVBB2（aa）、VVBB6（b）、黄酮类母核（cc）结构图Fig.2 The parent structures of VB2， VB6and fl avonoids

依据荧光与分子结构的关系，此3 种物质都有共轭双键体系且都是刚性的平面结构，见图2，VB2和VB6环上的取代基大部分为给电子基团所以都会产生荧光。依据羰基类化合物和不饱和含氮化合物及芳香族化合物的紫外-可见吸收光谱可知，280 nm波长附近的吸收峰应是橙汁中所含的橙皮苷类黄酮物质所有，380 nm为VB6吸收波长，460 nm是VB2吸收波长。VB2吸收波长大于VB6，是因为VB2的共轭体系远大于VB6，使π-π*跃迁能量降低导致荧光峰值波长红移［23-25］。

2.1.2不同品种橙汁来源识别

图3　7 种橙汁同步荧光光谱图Fig.3 Synchronous fl uorescence spectra of seven orange juices

由图3 A、B可知，脐橙和某品牌果汁同步荧光光谱等高线图图形很相似，在设定的激发波长（240～640 nm）范围内都有荧光吸收。都只在一个强的荧光吸收峰，前者位于350～525 nm之间后者位于325～540 nm之间，且波长间隔都在20～30 nm之间。

图3E、D即对应芦柑和金橘，二者的同步荧光光谱等高线图图形也接近。同图3A、B一样在设定的激发波长（240～640 nm）范围内都有荧光吸收，也都只有一个强荧光吸收峰。但是相比于图3A、B，图3C、D荧光峰处的波长间隔较小，为20～23 nm。图3C的荧光峰激发波长在360～510 nm之间，图3D位于350～520 nm之间。

图4　不同原料的55%果汁二维同步荧光光谱图Fig.4 Two-dimensional synchronous fl uorescence spectra of 5% juices from different fruits

芦柑、蜜橙和赣南橙的等高线图相较于上面4 种材料在荧光峰处基本已分化为2 个峰，且前2 者中心位置都在约380、460 nm波长处，而赣南橙在400、475 nm波长附近。这与图4所给出的信息相呼应。之所以在A、B、C、D、4 种橙汁中没有分开，是因为这2 个峰间隔近且峰强相等，而且可能由于此4 种橙汁中VB2、VB6含量相对较多、且分子支链取代基不同导致一峰蓝移一峰红移，而使两峰距离更加接近，还由于扫描速率快从而使两峰难以分开。

表1　不同橙汁光谱特征参数Table 1 Spectral characteristic parameters of orange juices

图4中280 nm附近的黄酮荧光峰脐橙、金橘、芦柑3 种橙汁较另4 种橙汁明显，可能由于前3 者中黄酮含量高所致。其中赣南橙的峰位向右平移20 nm，见表1。可能是品种不同导致。此峰在指纹图谱中没有显示出来与其荧光强度弱以及作图软件平滑处理有关。

由上述同步荧光指纹图、二维图及从中提取的特征值数据表可以看出7 种橙汁很相似，但各有细微特点。可借助这些细微特点实现对不同来源橙汁的鉴别分析。此外，也可看出市售的汇源橙汁没有掺杂掺假及防腐剂等物质，在荧光分析中符合鲜榨橙汁的规律。

2.2PCA

图5　6 种橙汁同步荧光光谱数据PCAA图Fig.5 PC1-PC2 score plot from PCA analysis for six orange juices

按照前面的分析，在激发波长240～640 nm，波长间隔为30 nm条件下进行光谱采集以得到数据来进行PCA。图5结果显示前2 个主成分的累积贡献率已经达到100%，说明前2 个主成分包含了全部光谱数据所具有的信息，可将其中橙汁完全分开。图5中A、B、C果汁、丑柑汁、赣南橙汁都分布在PC1轴方向上得分为负。D、E脐橙汁和蜜橙汁及金橘汁与前三者相反，在正方向上。因此，可先分成2 类。且对于A、B、C在PC2方向上：B和C一个为正一个为负，很容易区分，A在二者之间接近PC2的零点。所以这三者可以很好地分开。D金橘和E也有相似的趋势，所以利用PCA可以实现对橙汁的同步荧光光谱数据进行先聚类，再利用类群分布位置进行很好地区分。

3　结 论

根据荧光与分子结构之间的关系，理论与实验结果都表明橙汁中含VB2和VB6、黄酮类等荧光物质。某品牌橙汁与鲜榨橙汁荧光特性一致，这可能是由于没有添加柠檬酸、山梨酸钾、苯甲酸钠等荧光性添加剂而加入的是无荧光性质添加剂或者是添加量太低，此法检测不出，也有可能是其中没有加入添加剂［26］。用PCA对光谱数据进行分析，每种橙汁聚类都很明显，可以根据其在得分图中的聚类位置对其进行区分。本实验的结果可以为鲜榨橙汁的检测提供参考，若是三精水或者稀释果汁其荧光图谱会与上述的不同或者峰值处荧光强度显著变化，也可为其他饮料类食品的品质检测提供一个思路。

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Synchronous Fluorescence Spectroscopy Combined with Principal Component Analysis to Identify Orange Juice Quality

ZHANG Xiaoli， MAO Lixin， FAN Sanhong*
（College of Life Sciences， Shanxi University， Taiyuan 030006， China）

Synchronous fluorescence scanning was conducted on freshly prepared orange juice and commercial orange juice to obtain the three-dimensional fl uorescence spectra. Three groups of characteristic peaks were obtained and based on their fl uorescence characteristics， these peaks were identifi ed as VB2， VB6and fl avonoids， respectively. At the same time，the synchronous fl uorescence spectral data of all the orange juice samples obtained by scanning at excitation wavelengths of 240-640 nm with a wavelength difference of 30 nm compared to the emission wavelength were analyzed using principal component analysis （PCA）. Quite good results were obtained showing that the combination of fl uorescence spectroscopy and spectral pattern recognition method can provide the powerful technical support for the identifi cation of orange juice quality. Key words: orange juice； synchronous fl uorescence spectrometry； principal component analysis （PCA）

TS225.1

A

1002-6630（2015）18-0162-05

10.7506/spkx1002-6630-201518029

2014-12-18

张晓丽（1990—），女，硕士研究生，研究方向为食品工程。E-mail：1329757817@qq.com

范三红（1963—），男，副教授，硕士，研究方向为食品贮藏与加工工艺。E-mail：fsh729@sxu.edu.cn