茎瘤芥种子和叶片中硫苷的提取与纯化

张燕，修心宇（长江师范学院生命科学与技术学院，重庆涪陵，408100）

茎瘤芥种子和叶片中硫苷的提取与纯化

张燕，修心宇
（长江师范学院生命科学与技术学院，重庆涪陵，408100）

研究了不同料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20）、提取时间（10、15、20、25 min）、提取温度（50、60、70、80℃）对茎瘤芥种子和叶片中硫苷提取量的影响。试验结果表明，种子与叶子的硫苷在质谱仪中出峰时间均在1 min内，种子内的硫苷含量和纯度均高于叶片。当料液比为1∶15（g∶mL）、温度70℃、时间20 min时，提取的硫苷量最大。

茎瘤芥；硫代葡萄糖苷；提取；纯化

硫代葡萄糖苷（glucosinolates，简称硫苷）是一类含硫次级代谢物，多数分布在海绵体、高等植物、红枣等450多种生物中，在芸薹属植物中含量最高［1，2］。在已发现的120多种硫苷中［3，4］，十字花科植物含有62种，其中有19种在芸薹属作物中被检测出。硫苷本身较为稳定，细胞液泡中含量最高，当植物体遭遇伤害时，硫苷会降解［5］，减缓伤害作用。硫苷及其降解产物的生化特性较为活跃，在抗癌领域已吸引了众多研究者的关注，并得到了广泛的认同［6～8］。研究发现，食用十字花科蔬菜可以降低癌症的发病率，减少癌症对人体健康的危害［9～14］。

20世纪70年代以前，主要是利用纸色谱和薄层色谱法对硫苷进行分离［15］。20世纪90年代后，硫苷的分析方法主要是高效色谱质谱联用法（LC-MS），但这种方法要对样品原料实施脱硫处理，消耗的时间较长。而反相离子对色谱的出现，解决了上述种种问题，成为一种较为理想的分离方法。

十字花科植物中硫苷及其降解产物的生物活性极其活跃，在抗肿瘤和抑菌活性领域已得到众多研究者的关注和证实。茎瘤芥 （Brassica juncea（L.）Czern.et Coss.var.tumidaTsen et Lee）为十字花科蔬菜，目前未见茎瘤芥内硫苷提取、纯化的报道。因此，以茎瘤芥的种子和叶片为材料，对二者所含硫苷进行提取和分化，为其抗癌领域的应用提供支撑。

1　材料与方法

1.1试验材料

茎瘤芥种子，储藏期3 a，由重庆市涪陵绿原农业科技发展公司提供；叶片，购于涪陵超市，品种名称均为永安小叶。

1.2试验仪器

KH-250DB型数控超声波清洗器，南京温诺仪器设备有限公司生产；Xevo G2-S QTof质谱仪，沃特世科技（上海）有限公司生产；RE-52C真空旋转蒸发仪，西安博奥仪器有限公司生产；LGJ-10型真空冷冻干燥机，MIT三丰仪器科技有限公司生产。

1.3试验方法

①工艺流程茎瘤芥叶片清洗、风干→将种子、叶片在电热鼓风干燥箱内干燥→研成粉末→乙醚脱脂→甲醇提取→离心取上层清液→真空旋转蒸发去甲醇→质谱仪检测→葡聚糖凝胶离子交换柱除杂→色谱仪纯化→真空冷冻干燥机浓缩。

②试验前处理茎瘤芥种子和叶片购回后，将叶片洗净，并用细线串联起来，于室内自然风干7 d，待叶片表面枯干后，同种子一起放入95℃的电热鼓风干燥箱内，烘干时间为24 h。待种子和叶片彻底干燥后，取出置于研钵内研磨，研磨得越细越好。

1.4硫苷的脱脂

取10个规格相同的索氏提取器，每5个为一组，用橡皮管串联起来。种子与叶片粉末各取5 g，并依次用滤纸包裹起来，分别放在每组的索氏提取器内，同时将无水乙醚倒入蒸发瓶内。

取2个数显恒温水浴锅通电，温度设置为60℃，待水浴锅温度恒定，将串联的索氏提取器分别置于2个水浴锅内。因为乙醚是毒性物质，并且挥发性极强，所以整个脱脂过程需要在通风橱内操作。

脱脂的时间大概为5 h。刚开始脱脂时，虹吸出来的溶液颜色为深绿色，随着脱脂虹吸次数的增加，溶液颜色由深绿色渐渐变浅。由于脱脂时间较长，且乙醚的挥发性极强，所以在脱脂过程中，要及时向蒸发瓶内添加乙醚。当虹吸出来的溶液为无色时，结束脱脂。按此方法，将种子与叶片粉末各脱脂12次。脱脂结束后，取出索氏提取器内的原料包，并将滤纸打开置于通风处，自然挥发15min即可去除原料中的乙醚。

1.5硫苷的提取

硫苷的提取剂为70%的甲醇溶液。为了确定提取的最佳方法，首先将种子和叶片粉末与70%甲醇溶剂混合，料液比1∶15（g∶mL，下同），在50、60、70、80℃的数控超声波清洗器内分别振荡提取，20 min后结束振荡，然后上述提取过程重复1次。最后种子和叶片粉末以料液比1∶15于70℃数控超声波清洗器内分别提取10、15、20、25 min后结束震荡。

种子和叶片原料提取后，在3 000 r/min下离心15 min，结束后，将上层清液分别盛于小烧杯中。

由于分离后的上层清液中含有大量甲醇，所以采用真空旋转蒸发法去除。将种子与叶片分离后的上层清液分别倒入蒸发瓶内，打开冷凝装置的进水阀门，并开启真空泵，同时蒸发仪的条件设置为100 r/min，温度为50℃。当冷凝过程中，甲醇溶液不在滴落，即结束蒸发。整个蒸发过程大概需要150 min，蒸发后的溶液为深绿色油状物质即硫苷的粗提取物，最后将硫苷的粗提物置于冰箱内低温保鲜。

1.6质谱检测

选取相同条件提取的种子与叶片粗提物，再一次离心分离，并取上层清液进行真空抽滤，再通过质谱仪进行检测，检测条件为：流动相为乙腈∶水=20∶80；色谱柱：反相C18柱；离子极性：负离子；检测波长：229nm。

1.7硫苷的纯化、浓缩

取粗提物倒入DEAE Sephadex A-25葡聚糖凝胶离子交换柱中，当粗提物流尽时，用 40 mL 0.02 mol/L醋酸钠溶液洗涤，然后用40 mL水冲洗。最后以40 mL 0.5 mol/L硫酸钾溶液洗脱［16］，收集到的液体通过色谱仪分析纯化，要求为：流动相为乙腈∶水=20∶80；检测波长：229nm；色谱柱：反相C18（4.6mm×150mm）分析柱；流速：1mL/min。找出与质谱图相同的硫苷峰，在反相C18（10 mm×250 mm）制备柱，流速3 mL/min的条件下多次收集该时间段的硫苷峰，将收集到的溶液盛装在锥形瓶内并于冰箱内冷冻。

开启真空冷冻干燥机，将盛装样品的锥形瓶置于干机罩内，当屏幕显示-25℃时开启真空泵。干燥时间大概3～5d，当锥形瓶内无液体，出现结晶时干燥结束，此结晶即为样品浓缩后的硫苷纯品。

2　结果与分析

2.1种子样品的检测分析

粗提物的硫苷以钾盐的形式存在，在负离子模式下，得到0.7 min时的硫苷碎片峰。如图1所示，从质谱图中可以发现种子原料较为纯净，各离子峰的出现较为稳定。m/z（质荷比）为358.028 48处的离子峰响应最高，而此峰与黑芥子苷钾盐的［M－K］－相一致，由此可以说明，m/z为358.028 48处的峰即为本试验需要检测的硫苷峰。

图1　种子硫苷的质荷比

2.2叶片样品的检测分析

在负离子模式下扫描，得到1 min时放大的硫苷离子碎片峰。如图2所示，从质谱图中可以发现叶片原料不是很纯净，离子峰的出现较为杂乱。将1min内所有的离子峰进行放大处理，发现了m/z为358.028 48处的峰，而此峰与黑芥子苷钾盐的［M－K］－相对应，由此可以说明，m/z为358.02848处的峰即为本试验所需检测的硫苷峰。但是峰带在133.014 64、153.023 29、197.80882等时，峰值高，是由于纯化效果不是很好，另外，在同等量的料液比中叶片内硫苷含量极低。

图2　叶片硫苷的质荷比

2.3HPLC制备后的硫苷分析

取15 μL粗提取的硫苷液进样，通过反相C18（10 mm×250 mm）制备柱制备后，再由反相 C18（4.6 mm×150 mm）分析柱分析，得到分离、纯化后的分析色谱图。如图3所示，硫苷峰的响应值较高，且峰形较好。分析得到硫苷出峰时间约为1.399 min，说明多次收集此处硫苷峰即可得到分离纯化后的硫苷纯品。

图3　纯硫苷的HPLC图谱

2.4提取条件对硫苷量的影响

①料液比如图4所示，料液比为1∶5～1∶15时，种子硫苷提取量呈匀速上升趋势，1∶15时硫苷量最高。继续增加料液比，硫苷量基本保持不变。料液比为1∶5～1∶15时，叶片硫苷提取量也逐渐上升，料液比为1∶10～1∶15时，硫苷提取量上升最快，当比例为1∶15时，硫苷提取量达到最高，之后随着比例的增大，硫苷提取量几乎保持不变。说明，料液比为1∶15为硫苷提取的最佳比例。

②时间如图5所示，当提取时间不断增加，硫苷的提取量持续增大，提取时间达到20min时，硫苷提取量达到最高；继续增加提取时间，硫苷提取量几乎不发生变化，说明硫苷提取量最佳提取时间为20min。

③温度如图6所示，当温度为60～70℃时，种子和叶片中硫苷提取量随着温度的上升而增加，当温度为70℃时硫苷提取量最大，温度为70～80℃时硫苷提取量变化不明显，当温度高于80℃时，硫苷提取量逐渐降低，这可能是由于温度过高导致部分硫苷的分解所致。说明，70℃为硫苷提取量的最佳温度。

3　讨论与结论

本研究首次对茎瘤芥种子和叶片进行硫苷的提取与纯化，通过甲醇溶剂的提取后，得到了硫苷的粗提物，其为深绿色油状物质，并伴有特殊刺激性气味。对硫苷的粗提物进行离心分离、旋转蒸发去甲醇、真空抽滤后采用质谱检测，通过种子和叶子粉末以料液比分别为（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20）（g∶mL）进行等量提取，由图1、2可知，发现种子的硫苷离子碎片峰和叶子的离子碎片峰均在1 min内出现，种子的峰值高于叶子，说明种子要高于叶子中的硫苷含量。将粗提物通过DEAE SephadexA-25葡聚糖凝胶离子交换柱除杂，经高效液相色谱分离纯化，找到与质谱中相同的硫苷峰，并多次收集1.399min时间段的硫苷物，将收集液冷冻，再通过真空冷冻干燥3～5d，最终得到了晶体物质，即为硫苷纯品。在多次试验后，得到并证实了茎瘤芥种子和叶片中硫苷的最佳提取条件：原料与甲醇剂量的比例为1∶15（g∶mL），提取温度70℃，提取时间20min。而邓艳美等［17］试验发现，原料与提取剂比例为1∶7（g∶mL）、提取时间25 min、提取温度80℃时，青花菜中硫苷的提取量达到最大，由此说明虽然同属于十字花科类植物，但物种的不同，导致硫苷的提取条件也不同。因此，在提取不同种类植物内硫苷物质时，应该确定最佳的提取方法。

图4　硫苷提取量与料液比的关系

图5　硫苷提取量与时间的关系

图6　硫苷提取量与温度的关系

硫苷存在于十字花科植物中，降解后能够防御害虫，而当前最为引人注目的就是异硫代氰酸盐的抗癌作用，因此，研究硫苷的提取与纯化有重要的意义。本研究在原料的选取上进行了创新，成功地对茎瘤芥种子和叶子进行提取、纯化，下一步将开展茎瘤芥中硫苷酶解研究，为今后试验提供相应的理论依据。

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Extraction and Purification of Glucosinolates in Tumorous Stem Mustard Seeds and Leaves

ZHANG Yan，XIU Xinyu
（Life Science and Technology College，Yangtze Normal University，Chongqing，408100）

This paper studied the effects of different material-water ratio（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20），extracted time（10，15，20，25 min）and extracted temperature（50，60，70，80℃）on glucosinolates extraction capacity of tumorous stem mustard seeds and leaves.The results showed that both retention time of seeds and leaves of glucosinolates were less than 1 min，and the content and purity of glucosinolates of seeds was higher than leaves.When the conditions were 1∶15（g∶mL）of material-water ratio，70℃ of temperature and 20 min of time，the extraction of the glucosinolates is of the largest amount.

Tumorous stem mustard；Glucosinolates glycosidase；Extraction；Purification

R284.2

A

1001-3547（2015）18-0045-05

10.3865/j.issn.1001-3547.2015.18.019

重庆市应用开发计划项目B类：从榨菜叶中提取异硫代氰酸盐的技术研究与应用（cstc2013yykfA10003）

张燕（1977-），女，讲师，硕士，主要从事细胞与分子生物学研究，电话：18716890293，E-mail：28789155@qq.com

2015-06-26