莲分子生物学研究进展

王剑雄　郑兴飞　刁英　胡中立

莲分子生物学研究进展

王剑雄郑兴飞刁英胡中立

柯卫东 男，武汉市蔬菜科学研究所副所长兼水生蔬菜研究室主任，推广研究员，享受国务院政府特殊津贴，水生蔬菜行业计划及“十二五”国家科技支撑计划首席专家，主持国家及省、市重大科研项目多项，《植物遗传资源学报》、《长江蔬菜》编委。长期从事水生蔬菜种质资源及育种研究，在水生蔬菜种质资源保护及创新、新品种选育、微型种苗繁殖技术研究与应用等方面有创造性贡献，有力推动了我国水生蔬菜学科建设及产业发展。发表论文、论著100余篇（部），制定农业行业标准9部，取得国家发明专利3项，获国家科技进步奖二等奖、第四届全国杰出专业技术人才奖等。

莲（Nelumbo nuciferaGaertn.）属于莲科（Nelumbonaceae）莲属（Nelumbo Adans），多年生水生宿根草本植物。莲属植物仅包含2个种：中国莲（N.nuciferaGaertn.）和美洲黄莲（N.luteaPers.）。中国是莲的起源中心之一，也是莲最大的栽培地，莲在我国栽培有着悠久的历史。根据形态和利用部位，莲被分为子莲、花莲和藕莲3个类型。莲的用途极广泛，其地下茎称藕，能食用，叶可入药，莲籽为上乘补品，花可供观赏。在我国，莲作为一种重要的水生蔬菜，在生长发育、遗传育种、组培快繁、品种分类等方面已进行了大量且深入的研究。近些年来，很多学者运用分子生物学技术开展了莲的品质鉴定、遗传多样性研究、基因克隆及功能分析等方面的工作，对深入研究莲的生长发育、新陈代谢，以及莲种质资源的保护、发掘和利用提供了分子生物学基础。

1　莲DNA分子标记技术

分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。分子标记具有快速、准确、多态性高、重现性好等优点，应用时能不受环境、组织部位和其他因素的影响。随着分子生物学及其相关技术的发展，各种DNA分子标记技术被应用于莲的亲缘关系分析、品种鉴定、遗传育种研究及遗传图谱构建中［1］；主要包括RAPD（Random amplified polymorphic DNA）、AFLP（Amplified fragment length poly-morphism）、SSR（Simple sequence repeats）和ISSR（Inter simple sequence repeats）等［2，3］。

RAPD标记是早期莲应用中最广泛的一种分子标记。郭宏波等［4～6］在2004年利用RAPD技术对32份莲品种进行了遗传多样性研究，扩增形成的207条谱带中多态带有193条，占93.23%，显示该属植物在我国具有丰富的遗传多样性，且有十分明显的遗传分化。之后，又对野生莲和千瓣莲资源进行了多态性分析，结果均表现出丰富的遗传多样性。An等［7］在2009年采用RAPD技术对我国18个省的94份莲材料进行种群遗传结构分析，结果表明莲具有丰富的遗传多样性，多态性位点百分率为67.15%。但RAPD技术在使用的过程中极易受到各种因素的影响，例如基因组DNA的复杂度、DNA模板的浓度和质量、PCR反应的循环次数等，限制了其推广和使用。

与RAPD相比，SSR标记具有共显性、多态性高、特异性强等优点，现在已经作为理想的分子标记广泛地应用于现代分子生物学的相关领域。Pan等［8，9］在2007年开发了11对莲SSR引物，在32个莲品种中扩增出42条多态性条带。随后，利用莲的EST序列开发了23个ESTSSR标记，对39个栽培中国莲、10个野生莲及1个美国莲进行了遗传多样性分析。全志武等［10］在2008年开发了16对莲基因组SSR引物，对10个藕莲推广品种进行了扩增验证，其中6对引物共扩增出15条多态性条带，并绘制了10个品种SSR指纹图谱。日本学者Nakao等［11］在2009年用11对SSR引物对16个中国莲品种进行PCR扩增，共扩增出43条多态性条带，可有效地鉴别这些莲品种，同时发现这11对SSR引物也可以有效地鉴别美国莲和中美杂交莲品种。Liu等［12］在2012年为了评估11份中国莲的遗传多样性和亲缘关系，开发了11对SSR引物，扩增出41条多态性条带，并用这些SSR引物对71份来自世界各地具有高度遗传多样性的莲品种成功地进行了聚类分析。最近，Yang［13］、Zhang Wei［14］、Li［15］等分别针对美国莲和中国莲开发了SSR引物，为莲的分子鉴定、遗传多样性分析、遗传图谱的构建、分子标记辅助育种等方面提供帮助。

ISSR是一种建立于微卫星DNA基础之上的分子标记，其开发成本低、转化率高、多态性高等特点，使得ISSR标记已广泛应用于植物品种鉴定、基因定位、遗传作图、进化及分子生态学研究中。Han等［16～18］在2007年用基因组中ISSR标记分析了华中地区野生莲遗传变异和克隆多样性，利用核糖体ITS、ISSR和RAPD标记分析了38个莲品种的遗传关系。2009年又用ISSR标记对湖北梁子湖的240个莲个体进行了异交率和遗传多样性分析。Tian等［19］在2008年利用ISSR标记分析了莲遗传多样性和亲缘关系。李长春等［20］在2011年用8个ISSR分子标记引物对39份莲藕品种进行遗传多样性分析，共扩增出89条带，其中有55条多态带，多态性比率平均为61.8%。通过遗传相似系数和聚类分析，能将39份藕莲品种完全区分开，说明ISSR标记技术能较好地从分子水平揭示出莲藕品种的遗传多样性。

此外，杨美等［21］在2011年利用AFLP分子标记，对395份花莲原始种质构建花莲核心种质资源，以加强对花莲种质资源的保存、研究和利用。You等［22］在2013年利用叶绿体DNAatpB-rbcL区序列和AFLP标记对120个莲个体进行了遗传关系分析，进一步研究了野生莲和栽培莲的遗传关系。Hu等［23］在2012年用AFLP和SSR标记对58份莲材料进行遗传多样性和亲缘关系分析，以提高育种效率和加强种质资源的保护。

2　莲功能基因的研究

植物生长在自然环境中极易受到各种环境因素胁迫的负面影响。近年来，随着自然灾害和人类生活影响的不断扩大，已影响到莲藕栽培品质和产量［24］，所以，近些年莲的耐胁迫相关基因的研究相对比较集中。超氧化物歧化酶（SOD）在植物中普遍存在，SOD能够增强植物在逆境中抵抗活性氧胁迫的能力。朱虹琳等［25］、Dong等［26］对莲铜锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）基因进行了克隆和序列分析。董臣等［26～29］在2010年克隆了莲抗氧化相关的四个基因：MnSOD、CuZnSOD、APX和CAT，研究表明莲抗氧化基因在面对短期胁迫时具有协同作用。李国林等［30］2010年采用SMART技术成功构建了藕莲和花莲顶芽的cDNA文库，为莲相关功能基因的克隆提供了序列资源。同时克隆并分析了NnGPXl和莲泛素转运酶 NnUBC，对莲进行冷、热、机械损伤、高盐、ABA、PEG等不同时间梯度的胁迫处理，发现NnGPXl和NnUBC表达水平在各种处理后都迅速升高，说明其在莲生长发育和面对胁迫环境时起着重要的调节作用。Diao等［31］在2014年克隆了莲谷胱甘肽过氧化酶（NnGPX）基因，并证明了莲谷胱甘肽过氧化酶具有耐盐性。除了以上这些胁迫相关基因以外，还有莲种子防御素基因、莲小分子热激蛋白基因sHSP17.5、多酚氧化酶基因和CBF2基因已经被克隆［32～36］，且均被证明和莲的抗逆性和胁迫相关。以上关于莲抗逆性和胁迫相关基因的研究对提高莲在胁迫环境中的生命力有一定的促进作用。

除了胁迫相关基因以外，与莲淀粉合成相关的基因研究是当下学者研究的重点。以淀粉为主的碳水化合物是影响莲产量和加工品质的主要因素，所以研究莲淀粉相关基因对莲产量和莲产品的加工都具有一定的帮助。Lu等［37］在2012年从莲品种“美人红”中克隆了调控直链淀粉合成的颗粒结合淀粉合成酶 （Granule-bound starch synthase，GBSS）基因，并用Real-time PCR进一步地分析了GBSS基因在淀粉合成方面的功能。Cheng等［38］在2014年也从“美人红”品种中克隆出了ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase）基因序列，并进一步证实了AGPase是控制淀粉合成的关键酶。张莉等［39］在2015年克隆得到LrSSS（可溶性淀粉合成酶Soluble starch synthase，SSS）cDNA序列，并对其结构作了初步分析。以上这些研究结果为莲淀粉合成代谢及分子机制的研究奠定了基础。

另外，Wu等［40］在2014年克隆了莲中苯丙氨酸氨裂解酶基因（NnPAL1），并对其进行了功能鉴定和分子进化分析，为被子植物的PAL蛋白家族的进化提供了新的见解。

以上的研究仅是关于莲基因克隆和表达模式的初步分析，未涉及基因的生物功能的详细阐述。目前仅有的生化功能研究来自对莲sHSP17.5基因的研究，证明了sHSP17.5基因在拟南芥异源表达中提高了拟南芥的耐热性［34］。

3　莲测序的研究

随着测序技术的发展，基因组测序变得越来越容易。中国古代莲的基因组测序工作由中国科学院武汉植物园在2013年5月完成，并释放了基因组数据（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/wgs/？val= AQOG01）［41］。同年武汉蔬菜研究所也公布了莲基因组测序数据，并分析找出了与莲种子长期存活和淀粉合成相关的基因，对开花植物的进化提供了新的见解［42］。此外，全志武等［43］在2011年对中国莲和美洲莲叶绿体基因组进行了测序，对比两组叶绿体基因组序列，开发了莲细胞器基因组分子标记，并结合其他80种植物叶绿体基因组序列，对莲属系统进化地位进行了分析。Cheng等［44］和Kim等［45］在2013年分别对不同莲地下茎发育时期和部位进行了转录组测序，找到了控制莲藕地下茎发育的关键基因。Wu等［46］在2014年对莲叶绿体基因组进行了精确的测序分析，为双子叶植物质体进化分析提供了新的见解。游永宁等［47］在2015年分别将野生花莲和栽培藕莲的转录组通过Illumima测序和组装，并据此开发了莲的EST-SSR标记。

目前，莲的基因组学才刚刚起步，但已经得到了广泛的关注。莲的基因组和转录组数据分析对其系统进化研究、分子标记开发、基因功能的验证等具有重大意义。

4　莲属染色体核型分析

莲属的两个种都是二倍体，染色体数目为2n= 16，具有8对染色体。王宁珠等［48］在1985年对20个莲品种进行了体细胞染色体的形态和核型分析，发现所有的品种都是二倍体。黄秀强等［49，50］和刁英等［51，52］分别对美洲黄莲和中国莲进行了核型分析，得出莲核基因组大小约为950 Mbp的结果，其8条染色体在中期时总长约18 μm，其中最长的1号染色体长达4.7 μm。在8对染色体中，第1、5对染色体形态为近端着丝点，第4、6、7对为近中部着丝点，第2、8对为中部着丝，第4、5对染色体上有随体结构。美洲黄莲的核型不对称系数为70.82%，中国莲的不同品种的核型不对称系数也在70%左右，所以莲为不对称核型。Diao等［53］利用分子核型和5S核糖体RNA基因间隔序列证明莲属物种遗传多样性是有限的，美国莲被视为中国莲的亚种更为合适。染色体核型分析为分子细胞遗传学研究提供了基础，是研究莲的分类、演化以及染色体结构、形态与功能所不可或缺的重要手段。

5　展望

我国莲研究起步相对较早，分子生物学研究也得到了大力的发展。随着分子生物学技术的不断发展，可以从分子水平对莲的基因功能、性状表达、遗传变异的机制进行阐明，加速了莲新品种选育，对促进莲产业的发展、提升莲产业的整体竞争力有重大意义。目前限制莲分子生物学研究的瓶颈和亟待解决的热点问题主要包括：与功能基因连锁的分子标记的开发和利用，以及转基因平台的建立。

5.1与功能基因连锁的分子标记的开发和利用

DNA分子标记的开发是近几年来莲分子生物学研究领域的热点，目前用该方法在莲的种质资源分类和鉴定、遗传多样性研究、遗传图谱的构建等方面都已经取得了大量的研究进展。但在莲的育种方面可以开发出与功能基因连锁的标记，直接筛选出优质、高产、抗病的莲新品种，实现分子标记辅助育种。莲具有丰富的种质资源，在分子生物学和相关学科的快速发展下，有望克服育种过程中的相关难点，缩短莲品种选育周期，更有针对性地培育出所需要的莲品种。

5.2转基因平台的建立

目前，关于莲的转基因尚未被报道，其原因主要有两点：其一是植物转基因是基于植物胚性愈伤培养基础上的，到目前为止，仅有何子灿等［54］在1987年用花莲胚性愈伤诱导分化出组培苗，刁英等［55］在2011年以鄂藕杂3号莲藕顶芽或侧芽的茎尖为外植体诱导胚性愈伤组织成功，并分化出幼苗，但胚性愈伤分化成苗率十分低。之后一直没有关于莲胚性愈伤的相关报道；其二是莲基因组序列的测序结果在2013年5月才公布。植物组织培养技术和清晰的遗传背景是转基因工作开展的基石，虽然以上两个原因使莲的转基因研究一直处于搁浅状态，但相信莲的基因组序列的公布将推进莲转基因研究和探索工作。

上述问题是阻碍莲分子生物学研究进程的瓶颈，是目前最有可能克服的难题，也是今后一段时间莲分子生物学亟待解决的热点问题。

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10.3865/j.issn.1001-3547.2015.18.014

国家科技支撑计划项目资助（编号：2012BAD27B01）

王剑雄，武汉大学生命科学学院，430072，E-mail：214065995@qq.com

郑兴飞，刁英，胡中立，武汉大学生命科学学院

2015-07-16