青藤碱对偏头痛模型大鼠中脑导水管周围灰质区NF-κB和COX-2表达的影响

易桂标， 杨 丽， 郝仁方， 张中菊

（1.遵义医学院附属医院神经内科，贵州　遵义　563003；2.遵义医学院研究生院，贵州　遵义　563003；3.遵义市第一人民医院，贵州　遵义　563002）

青藤碱对偏头痛模型大鼠中脑导水管周围灰质区NF-κB和COX-2表达的影响

易桂标1，2， 杨 丽1*， 郝仁方1， 张中菊3

（1.遵义医学院附属医院神经内科，贵州遵义563003；2.遵义医学院研究生院，贵州遵义563003；3.遵义市第一人民医院，贵州遵义563002）

目的 研究青藤碱对偏头痛大鼠中脑导水管周围灰质区（PAG）核转录因子-κB（NF-κB）和环氧化酶-2（COX-2）表达的影响，探讨青藤碱治疗偏头痛的可能机制。方法 60只健康SD大鼠随机分成对照组、模型组、尼美舒利组、青藤碱低、中、高剂量组，复制硝酸甘油型偏头痛大鼠。尼美舒利为阳性对照组，在制模、药物干预后，免疫组化检测大鼠PAG区NF-κB和COX-2阳性表达。结果 ①与对照组比较，模型组PAG区NF-κB、COX-2表达明显增多，差异有统计学意义（P＜0.01）；②与模型组比较，尼美舒利组和青藤碱高剂量组PAG区NF-κB、COX-2表达明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；③与尼美舒利组比较，青藤碱高剂量组PAG区NF-κB、COX-2表达无明显差异（P＞0.05）。结论 NF-κB、COX-2参与了偏头痛发病过程；青藤碱能较好地缓解硝酸甘油型偏头痛大鼠行为学变化，推测其作用机制可能是通过抑制PAG区NF-κB和COX-2的表达。

青藤碱；偏头痛；中脑导水管周围灰质；核转录因子-κB；环氧化酶-2

中脑导水管周围灰质（PAG）是参与中枢内源性镇痛调控的重要结构，内含有多种与偏头痛发作密切相关的炎性因子、神经肽类、神经递质以及雌激素及其相关受体［1-2］。青藤碱（正清风痛宁主要成分）是目前临床上用于治疗风湿类疾病的中成药，镇痛、抗炎疗效显著。将青藤碱注入家兔腹腔、静脉所能产生镇痛效应的剂量是侧脑室的12 000倍、13 000倍，表明其作用部位主要位于中枢［3］。青藤碱的镇痛、抗炎效应是否也可作用于PAG区，用于治疗偏头痛未见文献报道，故取其镇痛抗炎的疗效，观察其对偏头痛模型大鼠行为症状的改变和镇痛效果，来探讨作用于偏头痛的可能机制与途径，为临床使用提供实验依据。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物 清洁级SD大鼠（雌雄等数）60只，体质量（270±30）g，从第三军医大学附属大坪医院实验动物中心购得，许可证号为SCXK（渝）20070005。

1.1.2药物和主要试剂 青藤碱（正清风痛宁主要成分）由湖南正清制药提供；硝酸甘油注射液从河南润弘制药购得；尼美舒利从海南新中正制药有限公司购得；NF-κB p65检测试剂盒从北京中衫金桥试剂公司购得；COX-2检测试剂盒从武汉博士德试剂公司购得。

1.2方法

1.2.1实验大鼠分组及制模与干预 SD大鼠随机分为对照组、模型组、尼美舒利组、青藤碱低、中、高剂量组，每组10只，分笼饲养。除对照组不作特殊处理外，余各组均皮下注射硝酸甘油注射剂2 mL（10 mg/kg）制备偏头痛大鼠模型，隔天注射1次，共5次。在第2次造模后，尼美舒利按每日每次6 mg/kg灌服尼美舒利组，青藤碱按每日每次50 mg、100 mg、200 mg/kg灌服青藤碱低、中、高剂量组，每天灌服1次，连续7 d。

1.2.2硝酸甘油型偏头痛大鼠模型制备及行为学评价 造模：遵从Tassorelli将硝酸甘油注射液以10 mg/kg在大鼠颈部皮下注射制模，约4 min左右大鼠出现两耳充血发红，前肢不停挠头，爬笼明显，烦躁不安等被视作造模成功［4］。

评估：①耳红即记录大鼠制模后耳红开始及消失时间。②挠头即记录大鼠制模后挠头开始及消失时间。挠头开始时间，以连续挠头达5次以上为准，消失时间，则以一个时间段中大鼠挠头次数少于5次并出现倦怠、疲乏为准。③挠头次数即从制模后开始，每30 min为一个时间段，持续分段记录挠头次数［5］。

1.2.3切片制备及免疫组织化学 大鼠最后一次造模、灌服药后3 h，10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔内注射麻醉后，仰卧固定，剪开胸、腹腔，从心尖部缓慢置入穿刺针达主动脉并固定，剪破右心房。先快速灌注无菌生理盐水100～200 mL，随后灌注4℃4%多聚甲醛液100～200 mL，至大鼠肢体强直变硬、尾巴竖立后，终止灌注。断头后，依据诸葛启钏主译的《大鼠脑立体定位图谱》剥离中脑PAG区域的位置组织，于4%多聚甲醛液浸泡固定24 h，常规脱水、石蜡包埋。于石蜡切片机对其行连续冠状面切片，切片厚度25μm，贴于多聚赖氨酸处理过的载玻片，烤片机中58℃2 h烤干备用。石蜡切片，取1张贴于普通载玻片行常规HE染色，显微镜下观察确定组织结构未被破坏，行切片免疫组化染色。采用SABC法。操作步骤严格按说明书进行。

1.2.4阳性细胞记数 在光学显微镜下：NF-κB阳性细胞为卵形或梭形，细胞浆呈棕褐色。COX-2阳性细胞，染色较淡，主要为细胞核染色，随着染色程度的不同呈现棕灰色或棕色。每张切片40倍镜下取左上、下，右上、下和中央5个镜野，计数每个镜野阳性细胞总数，取均值。

2　结果

2.1大鼠行为症状学变化 硝酸甘油造模约30 min后，大鼠除对照组外，其余各组均出现两耳发赤，前肢不停搔头，爬笼、活动明显，烦躁不安等现象，此过程延续约3 h，继而出现倦怠、蜷卧，活动减少。在药物干预后，药物干预组与模型组耳红及挠头开始时间比较，无明显差异；青藤碱高剂量及尼美舒利干预组耳红及挠头消失的时间较模型组大鼠明显缩短；药物干预组大鼠各时间段挠头次数与模型组比较差异明显，具体结果见表1～2。

表1　各组大鼠耳红、挠头时间比较（±s，m in）

表1　各组大鼠耳红、挠头时间比较（±s，m in）

注：与模型组比较，*P＜0.05

组别动物数耳红开始时间耳红结束时间挠头开始时间挠头结束时间模型组10 3.47±0.36 179.58±3.64 4.33±0.53 182.12±13.11尼美舒利组10 3.52±0.53 162.36±7.39*4.17±0.75 163.28±8.10*青藤碱低剂量组10 3.54±0.50 178.49±6.06 4.37±0.68 177.34±8.27青藤碱中剂量组10 3.50±0.92 177.08±3.99 4.47±0.52 176.16±2.43青藤碱高剂量组10 3.63±0.91 162.94±11.34*4.22±0.85 158.60±7.79*

表2　大鼠不同时间段挠头次数的比较（±s，次数/30m in）

表2　大鼠不同时间段挠头次数的比较（±s，次数/30m in）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

0～30 min 31～60 min 61～90 min 91～120 min 121～150 min 151～180 min对照组组别动物数10 1.70±1.06 1.10±0.99 1.20±1.03 1.00±0.94 1.00±0.94 0.90±0.57模型组10 35.70±4.79*43.10±5.70*42.90±4.31*31.80±6.07*25.20±4.96*3.70±1.89*尼美舒利组10 24.00±5.98*#26.80±3.79*#27.00±3.37*#26.70±6.78*#14.90±2.99*#1.40±0.84*#正清风痛宁低剂量组10 32.90±5.17*33.90±2.92*#34.10±2.33*#29.40±4.22*24.65±5.37*2.90±1.73*正清风痛宁中剂量组10 30.00±2.94*#33.30±3.92*#32.90±3.57*#21.10±3.21*#16.3±4.03*#2.70±0.95*正清风痛宁高剂量组10 26.37±5.09*#29.90±4.01*#31.30±3.65*#19.5±4.14*#15.50±1.58*#1.70±1.06*#

2.2免疫组化检测 结果见表3及图1。

表3　各组大鼠中脑导水管周围灰质区NF-κB与COX-2阳性细胞表达结果

图1显示了各组大鼠中脑导水管周围灰质区NF-κB与COX-2阳性细胞表达结果：模型组PAG区NF-κB、COX-2表达与对照组比较，明显增多；尼美舒利组和青藤碱高剂量组（PAG）区NF-κB、COX-2表达与模型组比较，明显减少；青藤碱高剂量组PAG区NF-κB、COX-2表达与尼美舒利组比较，无明显差异。

3　讨论

NF-κB是许多靶因的多效性转录因子，广泛存在于细胞胞浆中，习惯上NF-κB主要为p50/p65异源二聚体，参与不少同炎症、免疫功能相关基因的调控。运用电刺激上矢状窦区硬脑膜复制的偏头痛大鼠，在其PAG内NF-κB蛋白表达明显增强［2，6］。预防性予以含NF-κB抑制剂的龙牙草，已被证明，可使偏头痛爆发频率减少、减缓其症状［7］。COX-2被称为“炎症反应基因”，并且是偏头痛发作时的重要炎性介质前列腺素（PG），尤其是前列腺素-E2（PGE2）合成的关键酶。研究还发现，环氧化酶（COX）抑制剂能缓解偏头痛发作，现已被试用于偏头痛的临床治疗［8］。COX-2的表达受NF-κB调控，NF-κB、COX-2是否与偏头痛联系密切，值得进一步研究。

硝酸甘油偏头痛大鼠模型能较好地模拟人类偏头痛发病时的表现，其行为症状变化是能用于客观且能量化评价偏头痛治疗药物疗效的合理指标［5］，其造模的主要原理之一是硝酸甘油在机体内通过一系列生理、生化反应，从而介导神经源性炎症引发偏头痛，所以还适于进行神经源性炎症机制研究。无先兆偏头痛是偏头痛中最主要的类型，参照国际头痛协会（2004年）制订的无先兆偏头痛诊断标准，其中之一是至少发作5次，故本实验共造模5次。

图1　各组大鼠中脑导水管周围灰质区NF-κB与COX-2表达

中脑导水管周围灰质（PAG）内炎性因子（如核转录因子-κB、环氧化酶-2、白介素-1等）、神经肽类，神经递质（如5-羟色胺、一氧化氮等）、雌激素等及其相关受体的含量变化及其功能异常，常可使PAG的结构与功能发生紊乱，进而影响了其对偏头痛中枢疼痛的调控，在一定程度上可能促进了偏头痛的发作。

神经源性炎症机制是目前阐述偏头痛病理机制学说的主流。该学说认为NF-κB的激活是神经源性炎症反应中的主要内容之一。静息状况时，NF-κB通常以非活化状态存于胞浆中，遇到伤害性刺激后，NF-κB迅速转位入胞核并结合特异性κB序列，进而被激活，诱导调控炎症反应相关基因（如COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、iNOS等）产生与转录，继而造成脑血管周围组织的炎症反应，从而引发偏头痛发作。

本实验研究发现：硝酸甘油复制的偏头痛模型大鼠PAG区NF-κB、COX-2表达相比于对照组明显增多，差异有统计学意义，提示硝酸甘油诱发了模型组PAG区的炎症反应，促使了NF-κB神经元的激活，进而诱导了COX-2基因转录的大量增加，从而启动了神经性炎症反应，同时也可导致PAG的功能紊乱，从而失去了对中枢疼痛的调控，由此引发了大鼠偏头痛样症状发作，同时也较好地验证神经源性炎症在偏头痛中的作用。并同时观察到在予以青藤碱、尼美舒利干预后，大鼠行为学改变与模型组相比，缓解明显，且青藤碱高剂量组和尼美舒利组PAG区NF-κB、COX-2表达与模型组相比明显减少，差异有统计学意义，提示两者对NF-κB、COX-2的抑制效应相当，差异无统计学意义。提示正青藤碱与尼美舒利一样，对治疗偏头痛有效，其作用机制可能与抑制PAG区神经细胞NF-κB、COX-2表达有关。

尼美舒利是环氧化酶-2抑制剂，故本研究选取尼美舒利为阳性对照组。同时其抗炎、镇痛作用显著，临床上用尼美舒利治疗偏头痛疗效也不错［9-10］。青藤碱（Sin）化学结构与吗啡类似，和脑的阿片受体或许有特殊的亲和力，并可透过血脑屏障［11］；研究证实青藤碱在小鼠中脑分布浓度较在大脑和小脑的浓度升高显著［12］；这些都是青藤碱具有中枢镇痛作用的有力证据。其抗炎效应与皮质类激素氟美松相当［13］，作用机理可能是干预了NF-κB激活通路，从而抑制炎症局部前列腺素的合成或释放［3］。实验结果显示这两者在缓解硝酸甘油诱发的偏头痛大鼠的行为症状学方面效果明显。

综上所述，本实验显示青藤碱能够明显缓解偏头痛模型大鼠的行为症状学变化，因此推测可能对偏头痛治疗有效。前期研究表明：青藤碱可下调偏头痛模型大鼠脑干炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表达，抑制c-fos、c-jun基因表达及5-HT能系统的激活［14-16］，本实验结果显示在偏头痛模型大鼠PAG区NF-κB、COX-2表达增高，用一定剂量的青藤碱干预偏头痛大鼠其行为症状学变化有较好的改善作用，其机制可能是通过抑制脑干PAG区神经NF-κB、COX-2的表达，下调炎症因子（IL-1β、TNF）的释放［17］，从而抑制了神经源性炎症反应，而达到缓解行为症状学的作用，以达到止痛目的。由此推测青藤碱对偏头痛治疗有一定的疗效，到底有没有效，还需要大样本的临床观察才能定论。

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R285.5

B

1001-1528（2015）03-0678-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.051

2014-01-18

遵义市科技局基金（201133）

易桂标（1984—），男，硕士生，主要从事神经病学研究。Tel：15200203825，E-mail：451241950@qq.com

杨 丽（1957—），女，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事偏头痛及脑血管疾病研究。Tel：（0852）28608747，E-mail：yangli1668@126.com