Box-Behnken设计优选藏药坐珠达西供试品溶液制备条件

任桂友，徐 燕，李春雪，曾 锐*

（1.西南民族大学化学与环境保护工程学院，四川　成都　610041；2.成都中医药大学药学院，四川　成都　611137）

Box-Behnken设计优选藏药坐珠达西供试品溶液制备条件

任桂友1，徐 燕1，李春雪2，曾 锐1*

（1.西南民族大学化学与环境保护工程学院，四川成都610041；2.成都中医药大学药学院，四川成都611137）

目的 采用Box-Behnken设计响应面法优化藏药坐珠达西的供试品溶液的制备条件，确定最佳的提取制备方法。方法 选取加甲醇量、超声时间、超声温度为考察因素，以没食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、绿原酸、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ8种成分量的总评归一值（OD）为指标，采用Box-Behnken设计优化坐珠达西样品的提取制备条件。结果 最佳提取制备工艺为加甲醇15 mL，超声30 min，超声温度为80℃，重复3次试验，各成分量的RSD在1.1%～2.7%范围内。结论 优选的提取制备条件稳定可行，可为坐珠达西质量标准研究的样品提取制备提供参考。

Box-Behnken设计；坐珠达西；供试品溶液；制备条件

Box-Behnken设计响应面法［1-3］是一种可以把实验设计和统计分析高效结合的综合实验方法。然该设计方法现多用于普通剂型处方的筛选，对于质量标准研究的供试品制备条件考察尚未引起足够重视。

藏药坐珠达西由35味药物组成，成分众多，且相互间存在一定干扰。因此科学准确的供试品制备方法，对最终的质量标准研究尤为重要。现今藏药坐珠达西的研究主要是集中在和其他药物配合的临床应用、重金属及毒性评价研究等方面［4-9］。本课题组前期建立了坐珠达西中没食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、绿原酸、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ8种成分定量测定方法［10］，后又以槲皮素、胡椒碱、齐墩果酸为代表探索黄酮、有机酸、生物碱同时鉴定的检测方法。现报道以没食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、绿原酸、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ8种成分量的总评归一值（OD值）为考察指标，优选坐珠达西供试品溶液制备条件，以确定其最佳提取制备方案。

1　材料

Waters 2695型高效液相色谱仪；2996PDA检测器；Empower化学工作站（美国）；ESJ200-4万分之一电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）；BT25S十万分之一电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ5200E型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。

没食子酸（批号111109）、苯甲酸（批号120807）、山柰酚（批号120718）、木香烃内酯（批号120322）、去氢木香烃内酯（批号120321）、西红花苷Ⅰ（批号120714）、西红花苷Ⅱ（批号110925）对照品（四川省维克奇生物科技有限公司）；绿原酸（批号121125）对照品（成都普菲德生物技术有限公司）。8种对照品纯度均≥98.0%；坐珠达西（丸剂）供试品（批号20130926，四川阿坝州藏医院藏医药研究所制）。流动相甲醇为色谱纯（OCEANPAK）；磷酸为分析纯（纯度≥85.0%）；提取用甲醇为分析纯（纯度≥99.5%），二者均购自成都市科龙化工试剂厂；水为纯净水。

2　方法与结果

2.1方法学考察

2.1.1色谱条件 Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为甲醇（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～8 min，13%～20%A；8～20 min，20%～38%；20～30 min，38%A～50%A；30～45 min，50%A～70%A；45～65 min，70%A～80%A）；体积流量为1 mL/min；柱温30℃；进样量10μL；没食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯和去氢木香烃内酯的检测波长为225 nm，绿原酸的检测波长为352 nm，西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的检测波长为455 nm。按照上述色谱条件进行测定，各组分间分离度良好，对照品及样品色谱图见图1。

2.1.2对照品溶液的制备 称取没食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯和绿原酸适量，精密称定，加甲醇配制或稀释成每1 mL含1.224 0、1.068 3、0.747 5、0.776 3、1.002 9、1.011 4 mg的溶液；再取西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ适量，精密称定，加稀乙醇配制或稀释成每1 mL含1.420 0、0.375 0 mg的溶液，即得各对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各2.5、1.5、1.0、2.0、3.5、3.5、0.5、0.5 mL于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得混合对照品溶液。

图1　对照品和样品HPLC图谱

2.1.3供试品溶液的制备 精密称取坐珠达西粉末1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密量取加入甲醇15 mL，密封称定质量，超声提取，待冷却至室温，再用甲醇补足失质量，摇匀，过滤即得。

2.1.4线性关系的考察 将“2.1.2”项下混合对照品溶液依次稀释为原液质量浓度的1/2、1/22、1/23、1/24、1/25，分别精密吸取不同稀释倍数及原质量浓度的对照品溶液各10μL进样，以进样质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程及相关系数，见表1。

表1　对照品的线性关系和范围

2.1.5精密度试验 精密吸取“2.1.2”项下稀释1倍的混合对照品溶液，按“2.1.1”项下所述色谱条件，连续进样6次，每次10μL，计算各组分峰面积的RSD。结果显示，没食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、绿原酸、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ峰面积的RSD分别为1.0%、0.6%、1.6%、0.7%、1.1%、1.5%、0.76%、1.6%，表明该仪器精密度效果良好。

2.1.6重复性试验 精密称取同一份坐珠达西样品粉末6份，按“2.1.3”项下所示方法平行制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定。结果显示，没食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、绿原酸、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ峰面积的RSD分别为1.7%、2.3%、1.0%、1.7%、2.5%、1.1%、1.3%、2.1%，表明该试验方法重复性良好。

2.1.7稳定性试验 精密称取同一份坐珠达西样品粉末，按“2.1.3”项下所示方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h时进样10μL，按“2.1.1”项下所述色谱条件进行测定，计算各组分峰面积的RSD。结果显示，供试品溶液中没食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、绿原酸、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ峰面积的RSD分别为2.8%、3.6%、2.4%、1.6%、1.5%、1.0%、3.2%、2.8%，表明该供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.8加样回收率试验 精密称取含有量已知的坐珠达西样品粉末6份，每份约1 g，置具塞锥形瓶中，加入各对照品溶液（使得加入对照品量相当于样品中含有量的80%～120%）适量，按“2.1.3”项下所示方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下所述色谱条件进行测定，计算各对照品的回收率和RSD，结果见表2。

2.2供试品制备提取工艺优选

2.2.1Box-Bhenken设计 以加甲醇量、超声时间、超声温度为影响因素，以没食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、绿原酸、西红花苷I和西红花苷II的含有量的总评归一值（OD）［11-13］为评价指标进行Box-Bhenken试验设计。各因素水平见表3。

2.2.2样品溶液制备 精密称取同一批坐珠达西样品粉末（批号20130926）17份，各1 g，按表4中的方案设计进行样品溶液制备，按“2.1.1”项下色谱条件测定没食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、绿原酸、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的含有量。

2.2.3模型拟合及数据分析 实验所得结果（见表4～表5，图2）经Design Expert8.0.5b软件进行多元线性回归拟合及优化，得到OD值对加甲醇量A、超声时间B、超声温度C的二元回归方程：

剔除不显著项（P≥0.05），重新拟合得到二项式方程

表2　8种有效成分的加样回收率（n=6）

表3　提取因素水平

表4　响应面分析方案及结果

表5　回归模型方差分析

2.2.4供试品制备工艺预测 由Design Expert8.0.5b软件分析得出的响应曲面图（图2）可知，加甲醇量对OD值影响最大。经Design Expert8.0.5b软件分析筛选、优化，得到供试品制备最佳工艺条件为：加甲醇量15mL，超声时间30 min，超声温度80℃。试验是将坐珠达西研成粉末再进行提取，考虑粉末体积大，甲醇量再少便不能使药粉与提取溶剂充分接触，故确定用15 mL的甲醇进行提取，同时为了实际操作需求，80℃的提取温度也不再做升高。

图2　响应面图

2.2.5验证试验 精密称取同一份坐珠达西样品粉末3份，按已优化的方法平行制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行分析。结果显示，没食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、绿原酸、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ含有量的RSD分别为2.7%、1.1%、0.9%、1.5%、2.3%、2.1%、1.5%、2.3%，表明所建数学模型具有良好的预测性，优选工艺条件稳定可靠。

3　讨论

3.1本课题组前期建立了没食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、绿原酸、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ8个成分的定量测定方法。本研究再次进行验证，并最终确定最佳制备提取方案为加甲醇量15 mL，超声时间30 min，超声温度80℃。建议在进行坐珠达西质量标准研究时，供试品制备条件应选用加甲醇量15 mL，超声时间30 min，超声温度参考试验的实际情况和条件而定。

3.2本实验中观察得知，不同试验条件下各成分测定结果差异很大，以木香烃内酯最明显，其最佳条件与最差条件下含有量差异达到了1.774 3 mg/g，故建议在试验过程中，供试品制备环节也要引起学者们足够的重视，以便确保最终试验结果的客观、科学、可靠。

［1］ 吴 伟，崔光华.星点设计-效应面优化法及其在药学中应用［J］.国外医药学分册，2000，27（5）：292-298.

［2］ 曾 锐，任桂友，王 爽，等.Box-Behnken设计及正交设计优选复方龙砂颗粒提取工艺［J］.中成药，2014，36（5）：202-205.

［3］ 林小玲，田成旺，张铁军.星点设计-效应面法优选参芪消炎颗粒渗漉提取工艺［J］.中草药，2013，44（4）：430-434.

［4］ 杜丽英.坐珠达西配合附子理中丸治疗原发性肝癌腹泻52例临床观察［J］.中医临床研究，2011，3（13）：35-36.

［5］ 王海苹.浅谈藏药坐珠达西的临床应用［J］.中国民族民间医药，2014，1（4）：4-5

［6］ 胡文玉.坐珠达西配合黄芪注射液以及小半夏丸治疗消化道肿瘤后呕吐的临床观察［J］.吉林医学，2011，32（8）：1500-1501.

［7］ 旦 增，许 晔，胡 忻，等.名贵藏药“坐珠达西”重金属含量分析及毒性评价［J］.西藏大学学报：自然科学版，2013，28（1）：32-36.

［8］ 徐莲琴，杨庆敏，王 烨，等.坐珠达西治疗消化性溃疡临床观察［J］.黑龙江医药，2009，22（3）：346-347.

［9］ 刘瑞珍.坐珠达西配合四神丸及黄芪注射液治疗肝癌腹泻32例临床疗效观察［J］.亚太传统医药，2011，7（9）：123-124.

［10］ 任桂友，刘海萍，王战国，等.藏药坐珠达西中8种成分HPLC定量测定［J］.中草药，2014，45（15）：2189-2193.

［11］ 符少莲，冯翠娟，李 沙.星点设计-效应面法优化脂溶性丹参提取物速释滴丸处方工艺［J］.中成药，2014，36（5）：690-695.

［12］ 陈卫卫，何炜玲，冯 看，等.星点设计-效应面法优选抗炎退热颗粒剂的成型工艺［J］.中成药，2011，33（9）：1610-1612.

［13］ 唐 梅，刘剑云，刘 英，等.Box-Behnken设计优化黄芩的浸渍-压榨提取工艺［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（3）：58-61.

R284.2

B

1001-1528（2015）03-0674-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.050

2014-06-20

国家“十二五”科技支撑计划（2012BAI27B07）；大学生创新项目资助（S201410656002）；校研究生学位点建设项目（2013XWD-S0703）

任桂友（1990—），硕士生，从事药物制剂及民族药的研究。Tel：13540108836，E-mail：rgy506189795@126.com

曾 锐（1976—），副教授，硕士生导师，从事药物制剂及民族药的研究。Tel：13981910281，E-mail：Mackzeng@ gmail.com