血管平滑肌细胞钙化后转化类型的研究

刘鸿昊，徐秋亚，刘 超*

（郑州大学第一附属医院心血管外科；河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南　郑州　450052）

・基础研究・

血管平滑肌细胞钙化后转化类型的研究

刘鸿昊，徐秋亚，刘 超*

（郑州大学第一附属医院心血管外科；河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南郑州450052）

目的 分析主动脉血管平滑肌细胞钙化后细胞转化类型。方法 将第4代细胞等量随机分为实验组和对照组，给予实验组10 mmol/L的β-甘油磷酸盐进行细胞诱导，给予对照组正常DMEM培养基培养，连续培养10天，测定两组碱性磷酸酶（ALP）活性及骨钙素的含量，采用Western blot方法检测VSMCs及成骨细胞标志蛋白（骨桥蛋白）含量的差异。结果 细胞诱导钙化后，细胞聚集并形成囊泡结构，实验组ALP、骨钙素含量较对照组有所增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；Western blot显示成骨细胞标志物含量较对照组明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；骨桥蛋白（osteopontin，OPN）表达逐渐增强，对照组仅有微弱表达，且随时间无明显变化，实验组OPN的表达明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 主动脉血管平滑肌细胞在钙化后会向成骨细胞转化，可为血管钙化通路、病因及治疗提供新的思路和研究机制。

细胞钙化；血管平滑肌细胞；钙化模型；成骨细胞

如今心血管钙化已成为普遍现象，许多心血管事件均与血管钙化有关，如心肌梗死、瓣膜钙化、夹层动脉瘤等疾病，这些疾病均有较高的致残率和致死率。血管钙化机制并没有完全明确，普遍认为血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）对血管钙化起着重要作用[1]，其作用机制及转化分型对研究心血管疾病发病机制有着重要作用，因此对VSMCs钙化后转化类型研究有积极的意义。本研究中，对VSMCs进行体外培养并诱导钙化，旨在探讨主动脉VSMCs钙化后细胞转化类型，为血管钙化的机制及通路研究提供重要基础。

1　材料与方法

1.1主要材料及试剂

血管平滑肌原代细胞（广州吉尼生物科技有限公司）；DMEM培养基（Gibco公司）；胎牛血清、双抗、胰酶（HyClone公司）；OPN单克隆抗体及过氧化物酶标记的抗鼠IgG（中杉金桥生物技术有限公司）；碱性磷酸酶检测试剂盒、β-甘油磷酸盐、茜素红染色剂及其他试剂耗材（郑州乐睿生物科技有限公司）。实验主要依托单位河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室。

1.2方法

1.2.1VSMCs体外钙化模型建立

原代血管平滑肌细胞置于37℃、5%CO2细胞培养箱中静置培养，待细胞长满培养瓶，底面积＞80%并形成致密细胞层后开始传代。将传至第4代的细胞等量随机分为实验组和对照组，给予实验组10 mmol/L的β-甘油磷酸盐进行细胞诱导培养，给予对照组正常DMEM培养基培养，换液1次/2 d，连续培养10天。

1.2.2碱性磷酸酶（ALP）测定

细胞弃去培养液，磷酸盐缓冲液（PBS）洗细胞3次，取六孔板，每孔加入500μl 0.1%Triton X-100（0.9% NaCl制备），4℃过夜，反复吹打使细胞破碎，收集于离心管中，1200r/min离心3 min，收取上清，按ALP检测试剂盒操作测定ALP活性。

1.2.3骨钙素含量测定

将两组细胞分别接种于25 mL培养瓶中，换液1次/3 d，连续培养10天。留置实验第0天和10天更换下来的细胞培养液，置-80℃保存。测量前先将500μL样品干燥浓缩成粉状，采用125I放射免疫法测量骨钙素，具体方法按试剂盒说明进行。实验重复2次。

1.2.4Western blot测定成骨细胞标志蛋白含量

收取两组细胞，裂解后取上清液，测定蛋白浓度，进行浓度测定及定量后，95℃5 min变性，加入1/3体积的4×SDS上样缓冲液，电转移蛋白至硝酸纤维素膜膜上，5%无脂奶粉封闭，一抗为OPN单克隆抗体（1:500），孵育杂交过夜，洗膜后在过氧化物酶标记的抗鼠IgG中孵育1 h，漂洗后ECL显色，曝光，扫描并分析。独立实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以“±s”表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结 果

2.1细胞钙化

经β-甘油磷酸盐诱导钙化后可见实验组大量钙化结节，茜素红染色后钙化细胞呈红色，并分布于整个细胞，对照组没有附着红色染料，实验组细胞在钙化诱导条件下有钙盐沉积，VSMCs钙化模型建立成功。

2.2ALP检测

两组ALP活性均随培养时间延长逐渐升高。实验组ALP第10天明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1　两组ALP活性的变化（，n=8）

2.3骨钙素含量

对照组中骨钙素含量很低，而实验组细胞骨钙素含量持续升高，且明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2　两组细胞培养液上清骨钙素含量变化（，n=8）

2.4成骨细胞标志物含量

Western blot显示，实验组OPN表达量明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1　两组细胞OPN表达，*P＜0.05

3 讨 论

血管钙化是一个与骨调节相关蛋白有关的主动调节过程，与临床心血管疾病的发生密切相关，课题组在前期查阅文献后综述示钙化的形式类似于软骨内成骨和膜内成骨；同时中膜自身的血管平滑肌细胞具有向成骨细胞转化的潜能[2]。本研究在上述结果的基础上，通过血管平滑肌体外细胞钙化模型，研究细胞钙化转化类型，为心血管疾病认识提供新的思路和研究机制。

本实验中细胞活性及其纯度是钙化诱导成功的关键[3]。我们采用10 mmol/L β-甘油磷酸盐作为诱导剂，β-甘油磷酸盐能在短期内诱导血管平滑肌细胞弥漫性钙化，与体内血管钙化形式非常接近，β-甘油磷酸盐是ALP的一种作用底物，在ALP的作用下分解产生无机磷酸盐并以囊泡的形式分泌到胞外，与胞外基质相互作用，形成钙化点；而10 mmol/L β-甘油磷酸盐能上调血管平滑肌细胞的ALP水平，促进钙化[1]。而对钙化的鉴定采用茜素红染色，茜素红能够螫合钙盐，使钙化细胞呈现红色或者橘红色。

研究发现，钙化发生的中心环节是VSMCs向成骨样细胞的转分化，VSMCs在诱导条件下（如炎性因子、TGF-β和高密度脂蛋白等）均可转变为具有合成和分泌功能的成骨细胞，能合成和分泌多种骨形成蛋白，从而发生钙化[4]。实验组中成骨细胞标志物的ALP、OPN、骨钙素含量在钙化后含量明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05），表明钙化过程中出现细胞类型变化—VSMCs向成骨样细胞转化。其中ALP是一个成骨过程中的关键酶，是反应成骨细胞成熟的标志性酶，其活性越高则提示成骨细胞的分化能力越强[5]；骨钙素是体内最丰富的非胶原类骨基质蛋白，是骨细胞成熟的晚期标志之一，也是表示成骨细胞活性的一种特殊蛋白质[1]，ALP和骨钙素通常用作分子标记，以确定血管平滑肌细胞的早期表型转化为成骨细胞样细胞；而Yamaguchi[6]等研究发现，骨桥蛋白可影响血管钙化的形成，但仍有一些学者在动脉粥样硬化斑块和钙化的主动脉瓣中检测到骨桥蛋白的表达[7]。

本研究说明在钙化过程中存在VSMCs向成骨细胞转化的可能，对临床心血管钙化疾病的研究具有重要意义。但血管钙化是一个复杂的过程，其机制仍需深入研究和探索。

[1] Zhan JK,Wang YJ,Wang Y,et al.The mammalian target ofrapamycin signalling pathway is involved in osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells[J].Can J Cardiol,2014,30(5):568-575.

[2] 郭朋举,刘 超.血管钙化的研究现状[J].中华胸心血管外科杂志,2013,29(4):233-236.

[3] Freise C,Querfeld U.Inhibition of vascular calcification by block of intermediate conductance calcium-activated potassium channels with TRAM-34[J].Pharmacol Res,2014,85:6-14.

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[5] 朱 磊,谭全海,肖紫春.转化生长因子-β2对骨髓间充质干细胞体外向成骨细胞分化的影响[J].中华实验外科杂志,2014,31(9):1983-1984.

[6] Yamaguchi A,Akashi T.Vascular calcification: mutual interaction between bone and blood vessel[J].Clin Calcium,2010,20(11):1669-1676.

[7] 邵 文,李书国.血管平滑肌细胞与血管钙化机制的研究进展[J].医学综述,2013,19(16):2898-2901.

本文编辑：李淑雁

R543.5

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ISSN.2095-6681.2015.18.186.03

刘 超，男，主任医师，E-mail：liubeilun@sohu.com

河南省教育厅科学技术研究重点项目（No.14B310016）