荧光素-Fenton体系荧光法测定中草药抗氧化活性

赵二劳*, 王迎进, 贾 楠， 赵三虎, 范建凤

(忻州师范学院化学系，山西忻州 034000)

自由基理论认为，生物机体疾病的发生发展与衰老是一个复杂的生物过程，它与自由基导致的机体细胞氧化损伤密切相关[1]。·OH是目前已知的机体内活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基[2]。它可以通过电子转移等反应，使机体内蛋白质、氨基酸、糖类、脂类和核酸等氧化损伤，引起机体组织细胞坏死或突变，导致机体衰老或发生肿瘤等诸多疾病[3 - 4]。因此，寻求自由基清除剂成为生命科学领域研究的热点之一[5]，而中草药的天然、丰富及低毒更受人们的青睐。

本文利用Fenton体系产生·OH，它能迅速氧化荧光素使其荧光猝灭，加入抗氧化剂使与荧光素作用的·OH量减少，导致体系荧光猝灭程度降低，据此建立了荧光法筛选抗氧化剂的新体系。应用该方法测定了金银花、黄芪、甘草、葛根、菊花、黄柏、蒲公英、夏枯草和山楂9种中草药提取物的抗氧化活性，方法简便、可靠和实用。

1 实验部分

1.1 主要仪器、试剂与材料

RF-5301 PC荧光分光光度计(日本，岛津公司)；KQ-400KDE型高功率数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FE20实验室pH计(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。

荧光素溶液：3.25 × 10-2mmol/L；FeSO4溶液：2.64 mmol/L；H2O2：0.024%；抗坏血酸溶液：1.94 mmol/L；硫脲溶液：4.10 mmol/L；NH3-NH4CI缓冲溶液：pH=10.5。实验试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。

所用中草药均购于当地药店。

1.2 实验方法

1.2.1激发波长与发射波长的确定在10 mL比色管中，依次加入0.3 mL NH3-NH4CI缓冲溶液(pH=10.5)，0.5 mL 浓度为3.25×10-2mmol/L荧光素溶液，2.0 mL浓度为 2.64 mmol/L FeSO4溶液，2.0 mL浓度为0.024%H2O2，二次蒸馏水定容至刻度，摇匀。反应10 min后，荧光扫描确定其最大激发波长和发射波长。

1.2.2·OH的测定取两支10 mL比色管，按1.2.1节的方法加入试剂(一支加Fenton试剂，一支不加)，以实验确定的发射波长为测定波长，分别测定加与不加Fenton试剂体系的荧光强度为F、F0，并计算△F=F0-F，则可间接求得·OH产生量。

1.2.3抗氧化剂对·OH清除率的测定按文献方法[5]测定抗氧化剂对·OH清除率，其计算公式为：S=(Fs-F)/(F0-F)×100%。式中：S为对·OH的清除率；加入抗氧化剂Fenton体系荧光强度为Fs，F、F0意义同1.2.2。

1.2.4中草药提取物抗氧化性的测定称取粉碎过40目筛的中草药金银花、黄芪、甘草、葛根、菊花、黄柏、蒲公英、夏枯草和山楂等各2.0 g，分别置于100 mL锥形瓶中，加入60 mL 60%乙醇溶液，浸泡1 h后，在温度40 ℃、超声波功率320 W的条件下，提取40 min，提取液过滤定容至100 mL。此溶液相当于1 mL 提取液中含有20 mg中草药溶出物[6]，即20 mg/mL。取0.2 mL按1.2.3方法测定。

2 结果与分析

2.1 荧光光谱

以490 nm为激发波长，在400～650 nm范围内扫描荧光发射光谱，结果如图1。由图1可知，荧光素最大发射波长为515 nm。其荧光峰为曲线1，被·OH氧化后荧光峰为曲线3，加入抗氧化剂后体系荧光峰为曲线2。显然，曲线1与曲线2之差△F1表示体系产生·OH的量；曲线2与曲线3之差△F2表示加入抗氧化剂使体系荧光猝灭降低的量，△F2与△F1之比，则反映抗氧化剂对·OH的清除能力。实验以λex/λem= 490/515 nm为测定波长，激发与发射狭缝宽度均为5 nm。

图1 荧光光谱Fig.1 Fluorescence spectra 1.Fluorescein+buffer;2.Fluorescein+buffer+Fe2++H2O2+sntioxidant;3.Fluorescein+buffer+Fe2++H2O2.

2.2 实验条件的选择

2.2.1酸度与缓冲溶液用量考虑到荧光素在酸性介质中基本不发荧光或荧光很弱，而碱性介质中发强荧光，荧光强度随pH的增大而增大，当pH10时，荧光强度达到最大，并基本保持不变[7 - 9]，故选择pH=10.5的缓冲溶液。考察缓冲溶液用量对体系△F的影响，在0.1～0.3 mL的范围内，△F随用量增大而增大，用量大于0.3 mL后，△F呈减少趋势，实验选作缓冲溶液用量为0.3 mL。

2.2.2试剂用量实验结果表明，3.25×10-2mmol/L荧光素溶液适宜用量为0.5 mL， 2.64 mmol/L FeSO4溶液适宜用量为2.0 mL，0.024%H2O2适宜用量为2.0 mL。

2.2.3反应时间按实验方法操作，每隔2 min测一次荧光强度，8 min内荧光强度随时间的增加而下降，8～20 min内，荧光强度基本不变，实验选取反应10 min后测定。

图2 硫脲与抗坏血酸对·OH的清除率Fig.2 Scavenging percentage on ·OH of ascorbin acid (1) and thiourea (2)

2.3 抗氧化剂清除·OH的能力

抗坏血酸与硫脲是常用的抗氧化剂。在荧光素-Fenton体系中，分别加入不同量的抗坏血酸溶液(1.94 mmol/L)和硫脲溶液(4.10 mmol/L)，按实验方法测定并计算清除率，以验证本方法的有效性，结果如图2。可见抗坏血酸和硫脲用量与其对·OH的清除率有明显的量效关系，表明该方法可用于筛选抗氧化剂。同时实验测得9份2.5 mL硫脲溶液对·OH平均清除率S=28.81%，相对标准偏差(RSD)为1.56%，表明本实验方法重现性良好。

2.4 中草药的抗氧化活性

按1.2.4实验方法测定9种中草药提取物对·OH的清除率，每种中草药平行测定3次，结果见表1。可见，所测9种中草药均具有·OH清除能力，即具有抗氧化活性，相对而言，甘草、菊花、金银花、葛根和山楂抗氧化活性更强。

表1 中草药对·OH的清除率(n=3)

3 结论

建立了一种测定中草药抗氧化活性的荧光分析新体系，应用该方法测定了金银花等9种常见中草药的抗氧化活性。实验表明，该方法简便快速，稳定可靠，具有较强的实用性，可用于抗氧化剂的筛选。同时实验也表明，甘草、菊花、金银花、葛根和山楂等中草药具有较强的抗氧化活性，说明这些草药中抗氧化物质含量较高，具有开发应用前景，值得进一步深入研究。