TWS119对结肠癌LOVO细胞系增殖能力和耐药性的影响

冯家豪　杨伟金　孙政

[摘要] 目的 探讨TWS119对结肠癌LOVO细胞系的耐药性和增殖能力的影响。 方法 将LOVO细胞系分成3组，分别为2 μmol/L TWS119处理组、1 μmol/L TWS119处理组和阴性对照组，TWS119处理组加入2、1 μmol/L的TWS119，对照组加入等体积DMSO，培养24 h后分别进行Western blot和qRT-PCR检测β-链蛋白（β-catenin）多药耐药相关蛋白1 （MRP1）及P糖蛋白（P-gp）的表达，用流式细胞分析检测细胞周期，用CCK8检测细胞耐药性变化。 结果 与阴性对照组比较，2 μmol/L TWS119处理组和1 μmol/L TWS119处理组细胞中MRP1、P-gp的mRNA和β-catenin、MRP1、P-gp的蛋白表达，G2/M期细胞比例均明显升高（P < 0.05）。虽然1 μmol/L TWS119处理组在5、10 μmol/L5-氟尿嘧啶（5-Fu）作用下存活率无明显变化（P > 0.05），但2 μmol/L TWS119处理组存活率明显升高（P < 0.05）；而且在15 μmol/L 5-FU作用下处理组存活率明显升高（P < 0.05）。 结论 在体外实验中，TWS119可以通过上调Wnt/β-catenin信号通路活性增强结肠癌细胞的耐药性和增殖能力，揭示癌细胞耐药性、Wnt/β-catenin通路和ABC转运体如P-gp、MRP1等存在联系。

[关键词] 结直肠癌；化疗耐药；TWS119；Wnt/β-catenin信号通路

[中图分类号] R73-36 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）09（a）-0027-05

[Abstract] Objective To discuss the impact of TWS119 on chemotherapy drug resistance and proliferation capacity of colon cancer cell line LOVO. Methods The cell line LOVO was divided into three group， 2 μmol/L TWS119 treatment group， 1 μmol/L TWS119 treatment group and negative control group， the TWS119 treatment groups were added 2， 1 μmol/L TWS119， the negative control group was added equal volume of DMSO， Western blot and qRT-PCR were performed to test the expression of P-gp， β-catenin and MRP1 after 24 h treatment. Flow cytometry and CCK8 test were performed to analyze the cells tolerance change. Results Compared with the negative control group， the mRNA expression of MRP1， P-gp， the protein expression of P-gp， β-catenin and MRP1， the G2/M period cell rate in 2 μmol/L TWS119 treatment group and 1 μmol/L TWS119 treatment group significantly increased （P < 0.05）； the survival rate with 5， 10 μmol/L 5-FU treatment had no significantly changed in 1 μmol/L TWS119 treatment group （P > 0.05）， while those in 2 μmol/L treatment group significantly increased （P < 0.05）， and the survival rate of both treatment group significantly increased with 15 μmol/L 5-FU treatment （P < 0.05）. Conclusion TWS119 can improve the chemotherapy drug resistance and proliferation capacity of colon cancer cell through increasing Wnt/β-catenin signaling pathway in vitro， these phenomena perhaps reveals there are some relationships among drug resistance of cancer cell， Wnt/β-catenin signaling pathway and the ABC transporter such as MRP1 and P-gp.

[Key words] Colorectal cancer； Chemotherapy resistance； TWS119； Wnt/β-catenin

在各种癌症中，全球结直肠癌患病率居第3位，仅次于肺癌和乳腺癌[1]。东亚结直肠癌发病率正在上升，可能与生活方式西方化、高脂低纤维饮食、肥胖和吸烟的流行有关[2]。大部分新发案例可以接受根治性手术[3]，但对于Ⅲ期结直肠癌患者，术后仍需化疗[4]；而且20%～30%新发病例有远处转移，这些患者即使进行根治性手术，仍有近50%的患者发生局部复发和转移[5]，对于这部分患者，系统化疗显得更为重要[4，6]。但单纯化疗并非根治手段，由于随着治疗的进展，癌症耐药性会逐步增强，这与患者药代动力学、药物和肿瘤类型、耐药机制、肿瘤微环境有关，机制非常复杂[7]。Wnt（wingless integration）信号通路被证实与人类癌症有关[8]，分为Wnt/β-catenin（cadherin-associated protein，β-链蛋白，β-1）通路、Wnt/Ca2+通路和WNT/PCP（planar cell polarity）通路[9]。有研究显示，相关基因突变导致的Wnt/β-catenin信号通路调控失调出现在大部分结直肠癌病例中[10]。Wnt/β-catenin可以调节c-myc和cyclin D1基因，它们在细胞生长、增殖和分化中起重要作用，在结肠癌中这些基因常常被异常激活[11]。TWS119是一种人工合成的小分子化合物，它可以促进老鼠胚胎腺癌细胞和胚胎癌细胞向神经细胞方向分化，而且发现其作用机制为抑制糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK-3β）的磷酸化作用，可使胞内β-catenin浓度升高进而上调Wnt/β-catenin信号通路活性[12]。但TWS119对人类结肠癌细胞的作用仍未有报道。本实验研究TWS119对LOVO细胞系的耐药性和增殖性影响，探讨其对人类结肠癌细胞的影响作用，进一步揭示Wnt/β-catenin信号通路与人类结肠癌细胞耐药性的联系。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和药物处理

LOVO细胞系（中山大学实验动物中心提供）分为2 μmol/L TWS119处理组、1 μmol/L TWS119处理组和阴性对照组。在含10%胎牛血清、100 μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素的RPMI1640培养基（Gibco），5%CO2、37℃无菌培养箱中培养，TWS119（Selleck）溶于DMSO中-20℃避光保存，处理组分别加入2、1 μmol/L TWS119[13]，阴性对照组加入等体积DMSO，培养24 h后进行后续实验。

1.2 qRT-PCR

收集细胞，用trizol试剂（invitrogen）提取细胞总RNA，用两步法qRT-PCR SYBER试剂盒（TAKARA）检测各组细胞MRP1、P-gp mRNA表达，各引物设3个复孔，引物序列（由Invitrogen公司合成）见表1。

1.3 Western blot

收集细胞，用细胞裂解液提取总蛋白，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后一抗孵育过夜，二抗孵育1 h，曝光后扫描，使用Image J软件分析灰度值。一抗、二抗均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.4 CCK8

调整细胞密度至5×104/mL，接种于96孔板，5-氟尿嘧啶（5-FU）设5、10、15 μmol/L 3个浓度梯度，阴性对照加等体积培养基，各设5个复孔，无菌培养箱中培养24 h，每孔加入10 μL CCK8试剂（碧云天）作用4 h后酶标仪分析吸光度，每组重复3次。

1.5 流式细胞分析

收集细胞，预冷PBS洗涤离心后用75%酒精固定过夜，碘化丙啶试剂（碧云天）染色30 min，流式细胞仪分析细胞周期。

1.6 统计学方法

采用统计软件SPSS 15.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组qRT-PCR结果

与阴性对照组比较，2 μmol/L TWS119处理组和1 μmol/L TWS119处理组细胞中P糖蛋白（P-gp）和多药耐药相关蛋白（MRP1）mRNA表达量显著增加（P < 0.05），且2 μmol/L TWS119处理组较1 μmol/L TWS119处理组P-gp和MRP1 mRNA表达量显著增加（P < 0.05）。见表2、图1。

2.2 三组Western blot结果

与阴性对照组比较，2 μmol/L TWS119处理组和1 μmol/L TWS119处理组细胞中β-链蛋白（β-catenin）、P-gp和MRP1蛋白表达量显著增加（P < 0.05），且2 μmol/L TWS119处理组较1 μmol/L TWS119处理组β-cateniu、P-gp和MRP1蛋白表达量显著增加（P < 0.05）。见图2、3。

2.3 三组细胞在不同浓度5-FU作用下CCK8试验结果

在5 μmol/L 5-FU作用下，2 μmol/L TWS119处理组LOVO细胞存活率高于1 μmol/L TWS119处理组和阴性对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；但1 μmol/L TWS119处理组与阴性对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。在10 μmol/L 5-FU作用下，2 μmol/L TWS119处理组LOVO细胞存活率高于1 μmol/L TWS119处理组和阴性对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；但1 μmol/L TWS119处理组与阴性对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。在15 μmol/L 5-FU作用下，2 μmol/L TWS119处理组LOVO细胞存活率高于1 μmol/L TWS119处理组和对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；1 μmol/L TWS119处理组存活率明显高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3、图4。

2.4 TWS119对增殖细胞比例的影响

阴性对照组G2/M期细胞比例为（6.42±2.62）%、2 μmol/L TWS119处理组G2/M期细胞比例为（17.8±1.60）%、1 μmol/L TWS119处理组G2/M期细胞比例为（11.63±1.59）%。与阴性对照组比较，2、1 μmol/L TWS119处理组中G2/M期细胞比例显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；且2 μmol/L TWS119处理组G2/M期细胞比例明显高于1 μmol/L TWS119处理组，差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

通常情况下在细胞内由轴抑制蛋白（axis inhibition protein，Axin）、结肠腺瘤样息肉蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）、酪蛋白激酶1（casein kinase 1）和GSK-3β组成的复合体对β-catenin有磷酸化作用，磷酸化的β-catenin随后被泛素-蛋白酶体降解，但Wnt与胞膜上的卷曲蛋白受体（frizzled class receptor）和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（low density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6）结合后，通过蓬乱蛋白（dishevelled segment polarity protein，DVL）使上述蛋白复合体受到抑制，β-catenin在胞内得以集聚，浓度升高。β-catenin通过核孔进入细胞核，可以与T细胞因子/淋巴增强结合因子家族（T-cell factor/lymphoid enhancer-binding factor，TCF/LEF）、环腺苷酸效应元件结合蛋白结合蛋白[cAMP response element-binding protein （CREB）-binding protein，CBP]等结合，促进多种转录反应[14-16]。

P-gp和MRP1同属ATP结合位点转运体（ATP binding cassette transporter，ABC transporter）家族成员。P-gp由ABCB1基因编码，在胞膜上有跨膜区-ATP结合位点，可以水解ATP释放能量引起构象改变，进而使底物排出细胞[17]。P-gp被证实与肿瘤耐药性有关，使癌细胞抵抗蒽环类、长春碱类和紫杉醇等化疗药的毒性[18]。MRP1是从P-gp表达缺失的耐药细胞株中发现的，由ABCC1基因编码，与P-gp类似的是，MRP1也有跨膜区-ATP结合位点这种功能性结构[19]。在乳腺癌、前列腺癌、肺癌等疾病中，MRP1过表达是化疗效果不佳的预示性指标[20]。

本研究结果表明TWS119可使人结肠癌LOVO细胞系β-catenin、P-gp和MRP1表达上调，明显提高细胞的增殖活性和5-FU耐药性，且存在剂量依赖性。该机制可能是TWS119选择性抑制GSK-3β磷酸化活性，导致β-catenin在胞内浓度上升而使β- catenin/TCF转录活性增强，其下游基因c-myc和cyclin-D1表达增加均可增强LOVO细胞增殖活性，而Wnt/β-catenin信号通路可能与ABCB1和ABCC1两个基因表达有关，致使P-gp和MRP1表达增加，对5-Fu的外排作用增强，导致细胞耐药性增加。

1 μmol/L TWS119处理组虽然有P-gp和MRP1的表达上调，但5、10 μmol/L 5-FU作用下耐药性较阴性对照组无明显增加，可能是由于胞内P-gp和MRP1表达需提高至一定水平才能显著影响LOVO细胞5-FU耐药性；在15 μmol/L 5FU作用下1 μmol/L TWS119处理组也有显著耐药性，可能是因为当底物5-FU浓度较高时，P-gp和MRP1的外排泵效率也相应提高。

本研究揭示癌细胞耐药可能与Wnt/β-catenin信号通路有关，希望可以为癌细胞耐药机制的研究提供思路。此外，TWS119在人类结肠癌细胞系中能影响信号通路的活性，可以用于信号通路的相关研究。

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（收稿日期：2015-04-08 本文编辑：苏 畅）