腺嘌呤诱导慢性高尿酸血症大鼠模型实验研究

乐心逸，刘　艺，李默影，孙　艳，沈龙海

（上海医药工业研究院，上海　200437）

腺嘌呤诱导慢性高尿酸血症大鼠模型实验研究

乐心逸，刘艺，李默影，孙艳，沈龙海

（上海医药工业研究院，上海200437）

目的通过对饲料中添加不同剂量腺嘌呤诱导的慢性高尿酸血症大鼠模型比较研究，筛选出饲料中添加腺嘌呤的最佳造模剂量。 方法将42只成年雄性SD大鼠随机分组：正常组（N）、模型1～6组（M1～6），每组6只。按不同比例的腺嘌呤粉末（1%、0.75%、0.5%、0.25%、0.1%）加入M1～5组大鼠的日常饲料中， 自由采食。M6组大鼠每日一次灌服腺嘌呤（200 mg/kg）， 持续21 d。实验期间与结束，主要观察大鼠体征、死亡率、血尿酸（UA）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）及肾脏形态学变化。 结果M1～5组UA、BUN、CRE均随造模时间的增加不断上升，其中M1、M2、M3组在7 d时UA、BUN、CRE已出现明显升高（P＜0.05）； M4、M5、M6组在20 d 其UA才出现显著上升（P＜0.05），整个实验过程中M1、M2组大鼠均有死亡，其余各组无死亡。实验结束解剖发现各组大鼠均有不同程度的肾肿大，M6组大鼠肾脏病变尤其严重。 结论通过对大鼠死亡率、血液生化指标和大鼠肾脏损害程度等因素综合比较，饲料中添加0.5%腺嘌呤为最佳的造模剂量。

慢性高尿酸血症； 腺嘌呤； 慢性肾病； 痛风

随着人们生活水平的提高、饮食结构和生活习惯的改变，动物蛋白、脂肪摄入大量增加，导致了高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）的发病率逐年上升。临床上， HUA常与高血压、肥胖、糖尿病、心脑血管疾病和肾脏疾病等并发［1，2］。长期的HUA可导致慢性间歇性肾炎和尿酸石的形成，从而严重影响患者的日常生活［3］。故对高尿酸血症肾损害的预防和治疗已引起越来越多的关注。合理的动物模型是筛选新型降尿酸药物的重要工具，但目前仍缺乏公认的高尿酸血症肾损害动物模型。借鉴现有文献资料［4-8］，作者选择饲料中添加不同剂量的腺嘌呤与直接灌胃的造模方法，希望能够找到稳定可靠、可重复、合理的慢性高尿酸血症大鼠模型用于药物研究。

1　材料与方法

1.1实验动物

SPF级SD雄性大鼠42只， 体质量160±20 g由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供［SCXK 2008-0016］，实验前在动物房饲养一周，全部实验过程中大鼠自由饮食饮水［SYXK（沪）2014-0018］，饲料由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供［沪饲证（2014）04001］。

1.2仪器和试剂

日立7080全自动血清生化分析仪； 腺嘌呤， 批号：Lot.X01012MA13， 购自上海源叶生物科技有限公司。

1.3动物分组和造模

大鼠适应性饲养一周后，随机分为正常组（N）、模型1～6组（M1～6），每组6只。正常组实验过程中正常饲养，M1～5组按照不同比例的腺嘌呤粉末加入大鼠每日的日常饲料中造模（比例依次为1%、0.75%、0.5%、0.25%、0.1%），M6组为每日一次腺嘌呤灌胃（200 mg/kg），连续21 d。

1.4指标检测

在造模7 d、14 d、21 d， 大鼠眼底静脉丛插管取血0.5 mL， 冰浴静置0.5 h后， 4 ℃， 13.8×g， 离心5 min， 取血清通过日立全自动血清生化分析仪检测血清尿酸（UA）、尿素氮（BUN）和肌酐（CRE）水平。

1.5组织学检查

造模结束后大鼠麻醉处死，剥离肾脏，固定，石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜观察。

1.6统计学处理

2　结果

2.1模型大鼠体质量和存活率

正常大鼠在饲养过程中状态稳定， 体质量持续上升，模型组大鼠随着饲养天数增加而日渐消瘦并伴有排泄增多、体毛干枯不齐、活动减少、耳鼻苍白等情况。M1、M2组大鼠于造模19 d和20 d出现死亡，造模结束动物死亡率为33.3%， 其余各组均未出现动物死亡。对死亡动物的解剖发现其肾脏均出现了严重病变，肉眼观察发现病变肾脏呈深棕色， 表明布满棕黄色颗粒， 体质量比较发现， M 1、M2组造模7 d与正常大鼠有极显著差异（P＜0.001），详见表1。

表1　实验期间各组大鼠体质量的变化　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　g

2.2大鼠血清UA、BUN、CRE水平

与正常大鼠相比M1～M3造模7 d 时UA值出现极显著上升（P＜0.001），其后2周也维持在较为稳定的数值，与正常组相比均有极显著统计学差异（P＜0.001）； M4～M6造模14 d 时UA值出现显著上升（P＜0.01）。

除M5外其余各组模型在造模7 d后BUN水平均出现显著上升（P＜0.05），且BUN上升的幅度与饲料中腺嘌呤的含量有一定剂量依赖性，整个造模过程中各组BUN水平均持续升高。

与正常组相比，M1～M3、M6在造模7 d后CRE水平均显著上升（P＜0.01）， 且上升的趋势和腺嘌呤含量呈正比； 造模14 d后除M5， 各组与正常组相比CRE均有显著统计学差异（P＜0.05）， 以M6组CRE的升高最为显著（P＜0.001），21 d时，各组CR水平均进一步上升（P＜0.05）， 有明显的剂量依赖性。

表2　实验期间各组大鼠血清UA、BUN、CRE水平比较　　　　　　　　　　　μmol·L-1

2.3模型大鼠肾脏病理学观察

肾脏病理形态改变（图1）： 正常对照组大鼠肾脏结构清晰，皮、髓质结构正常，肾小球、肾小管及间质均无异常改变（图1A）。与正常对照组比较，各模型组均可见肾小管内有大量结晶物沉着，有异物肉芽肿形成，占据整个管腔，肾小管上皮浊肿、坏死、脱落， 肾小管显著扩张成囊状，皮、髓质间质纤维组织增生，有大量炎性细胞浸润，可见纤维素样坏死（图1B、C、D、E、F）。且随着腺嘌呤灌胃剂量的增加其肾脏的损伤程度不断加重，其中腺嘌呤灌胃组肾损伤最严重（图1G），出现明显的肾脏膨大。

3　讨论

腺嘌呤为实验室建立慢性高尿酸血症动物模型最常用的药物之一，但在造模过程中肾功能损伤程度不易控制，大剂量时可导致动物死亡。不同文献报道的腺嘌呤慢性高尿酸血症造模的方法和剂量相差甚大，这可能与给药时间、给药方法、动物属种和体质差异等多项因素有关［9-13］。腺嘌呤造模一般采取灌胃方法，剂量范围在50～300 mg/kg，造模成功的时间7～30 d不等，但造模成功后模型组血尿酸水平随采血时间的不同存在一定的波动，同时剂量不容易控制，剂量过高会导致短时间内尿酸急剧升高、严重肾损伤，影响相关实验进行剂量过低不易造成慢性高尿酸血症模型［14，15］。本实验专门探讨了在普通大鼠饲料中添加腺嘌呤，自由采食的条件下，简便、迅速、稳定的建立慢性高尿酸血症模型方法［16］。

由实验结果可知，腺嘌呤饲料造模的M1～3组在7 d内均造模成功，与正常组相比UA值有极显著的升高（P＜0.001），并在之后的两周内保持在相对稳定的水平，M 4～6组UA上升较慢且上升效果弱于前三组。M 1、M 2、M 6在造模的7 d BUN值有明显上升（P＜0.01）， 在第二周时各模型组均有显著差异（P＜0.05）， BUN水平随造模天数不断上升， 有一定剂量依赖性； 与正常组相比， M 1、M 2、M 3 M 6在造模 7 d时 CRE值均有明显上升（P＜0.01）， 上升的趋势和腺嘌呤含量呈正比， M 6的CRE值上升最明显。这些指标说明使用腺嘌呤造模时大鼠肾功能已受到严重损害， 并且肾脏的损害程度随着腺嘌呤剂量的增加而增加， 其中灌胃给药的方法对肾脏的损伤最大。此结果与大鼠肾脏病理学切片观察相符

图1　大鼠肾脏组织病理学观察

本研究结果说明腺嘌呤灌胃法对肾脏的损伤远大于饲喂法，且在尿酸升高方面无明显优势。考虑到在筛选药物实验时如果几个指标过快上升很难对药物的药效学进行评价，特别是对于药理作用比较温和的中药，更难判断，最后结合大鼠的体质量、死亡率以及造模时间的考察，判断腺嘌呤饲料0.5%的造模方法最为简便、有效和合理用于筛选降尿酸药物以及肾功能保护作用的研究。

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Investigation on Helicobacter spp. Infection in Rat，Mouse， Guinea Pig and Rabbit

FENG Jie1， ZHANG Rong2， XIE Jian-yun1， LI Rui-jiao3， HU Jian-hua1， GAO Cheng1
（1. Shanghai Laboratory Animal Research Center， Shanghai Quality Monitoring Center of Laboratory Animals，Shanghai， 201203， China； 2. Institute of Neuroscience， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 200031， China；3. College of Chemistry， Chemical Engineering and Biotechnology， Donghua University， Shanghai 201620， China）

ObjectiveTo survey the Helicobacter spp. among rats， mice， guinea pigs and rabbits in Shanghai and surrounding area. MethodThe ileocecal region contents of rats， mice， guinea pigs and feces of rabbits were collected， and the bacterial genomic DNA were extracted. Both traditional PCR and multiplex PCR test were performed to investigate the Helicobacter spp. infection. ResultThe positive rate of Helicobacter spp. in rat， mouse， guinea pig and rabbit were 50.5%（105/208）， 37.9%（204/538）， 36.7% （36/98） and 4.9%（12/247） respectively. In addition， the triplex PCR test results of H.hepaticus， H.bilis， H. rodentium showed that H.hepaticus， H.bilis， infection can be detected in rabbit. H.bilis， H.rodentium can be detected in guinea pig. H.hepaticus， H.bilis， H.rodentium can be detected in rat and mouse. Conclusions There are different degrees of Helicobacter spp. infection in rats， mice， guinea pigs and rabbits of Shanghai and surrounding area.

Helicobacter spp.； PCR； Rodent； Rabbit

Q95-33

B

1674-5817（2015）02-0125-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.02.008

2014-10-13

上海市科学技术委员会科技支撑项目（编号： 13401900700）

乐心逸（1987-）， 女， 研究实习员， 研究方向： 药理学。E-mail： eyeeye88@163.com

沈龙海， 研究员。E-mail： 2443280705@qq.com