应用大鼠实验性痛经模型评价痛经停贴膏剂的镇痛作用

刘　瑾，隋在云，侯文静

（山东省中医药研究院， 济南 250014）

应用大鼠实验性痛经模型评价痛经停贴膏剂的镇痛作用

刘瑾，隋在云，侯文静

（山东省中医药研究院， 济南 250014）

目的应用大鼠实验性痛经模型评价痛经停贴膏剂的镇痛作用，初步探讨其治疗痛经的作用机制。方法制备大鼠痛经模型，扭体法观察不同剂量痛经停贴膏剂对受试动物的镇痛作用，ELISA法测定痛经停贴膏剂对模型动物血浆6-酮-前列腺素1α（6-Keto-PGF1α）含量的影响。结果痛经停贴膏剂对实验性痛经大鼠具有明显镇痛作用，可明显减少受试动物的扭体次数，延长潜伏期， 可使痛经大鼠血浆6-keto-PGF1α含量明显升高。结论痛经停贴膏剂对催产素所致子宫剧烈收缩的痛经大鼠有显著的镇痛作用， 其镇痛机制与其对血浆6-keto-PGF1α水平的调节有关。

实验性痛经； 痛经停贴膏剂； 扭体实验； 6-酮-前列腺素1α（6-Keto-PGF1α）； 大鼠

痛经停贴膏剂是在临床经验方的基础上结合现代工艺制成的纯中药制剂，由具有挥发性组分的当归、吴茱萸、乳香、没药、肉桂、细辛、元胡、樟脑等药物组成。经大量临床实践和科研病例观察， 本品具有活血化瘀、通经活络止痛之功效，对原发性痛经患者具有很好的临床疗效。本研究旨在通过考察痛经停贴膏剂对实验性痛经模型大鼠的镇痛作用，评估其抗痛经作用，并初步探讨其治疗痛经的作用机制，为其临床应用提供实验依据。

1　材料与方法

1.1动物分组与大鼠类痛经模型制备

SPF级雌性Wistar大鼠，未孕，体质量180～220 g，由山东大学实验动物中心提供［SCXK（鲁）2009-0001］，实验前用宠物电推剪将大鼠腹部神阙穴处皮肤脱毛，面积约为4 cm2，将大鼠按体质量随机分成空白对照组、模型对照组、痛经停贴膏剂高、中、低剂量组，共5组，每组10只。参考文献［1］方法制备大鼠类痛经模型： 除空白对照组外，其余各组大鼠连续灌服戊酸雌二醇片（补佳乐，拜耳医药保健有限公司广州分公司分装， 批号： 065A）10 d（第1日、第10日每日灌胃给药2.5 mg/kg其余8日均1 mg/kg）。

1.2给药方法

从灌服给予戊酸雌二醇片第7日起， 痛经停贴膏剂高剂量（0.566 g生药/cm2）、中剂量（0.283 g生药/cm2）、低剂量（0.141 g生药/cm2）组分别将药物涂抹在敷料布上，然后贴在大鼠腹部神阙穴处（神阙穴定位： 根据类比原理， 在大鼠胸腹正中线胸骨柄上缘至外生殖器连线上3/4与下1/4交界点取之［2］），用白胶布固定。空白对照组和模型对照组给予空白基质贴敷，每日1次，连续给药6 d。

1.3缩宫素扭体试验

各组于末次给药1 h后， 腹腔注射缩宫素2 U/只，立即秒表计时， 以扭体反应（大鼠腹部收缩内凹， 躯干与后肢伸展， 臀部与一侧肢体内旋）为子宫收缩痛经指标（注： 不发生扭体反应大鼠的潜伏期按30 min计）。观察并记录大鼠出现疼痛的时间（潜伏期）及30 min内的扭体次数，计算扭体抑制率。

扭体抑制率=［（模型对照组扭体次数-给药组扭体次数）/模型对照组扭体次数］×100%

1.4大鼠血浆前列环素（PGI2）含量测定（测定其代谢产物6-keto-PGF1α来表示）

各组于催产素扭体试验结束后，腹腔注射体积分数3%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉大鼠，经大鼠腹主动脉取血， 肝素抗凝， 3 000 r/min 离心15 min，分离血浆，采用双抗体夹心ELISA法，按试剂盒操作说明进行血浆PGI2的代谢产物6-酮-前列腺素1α（6-Keto-PGF1α）含量测定。

1.5统计学处理

表1　痛经停贴膏剂对缩宫素诱发大鼠痛经的影响

2　结果

2.1痛经停贴膏剂对缩宫素诱发大鼠痛经的影响

由表1结果可见，与空白对照组比较，模型对照组大鼠扭体反应的潜伏期明显缩短，30 min内的扭体次数明显增加，表明缩宫素作用于子宫引起的强烈宫缩可以引起大鼠产生腹痛，发生扭体反应，提示大鼠类痛经模型复制成功。与模型对照组比较，痛经停贴膏剂中、高剂量组大鼠扭体反应的潜伏期明显延长，高剂量组大鼠30 min内的扭体次数明显减少，提示痛经停贴膏剂对缩宫素诱发的大鼠痛经具有明显的镇痛作用。

2.2痛经停贴膏剂对缩宫素诱发痛经大鼠血浆6-keto-PGF1α含量的影响

由表2结果可见， 与空白对照组比较， 模型对照组大鼠血浆6-keto-PGF1α含量明显降低。痛经停贴膏剂中、高剂量组血浆6-keto-PGF1α含量均明显升高， 与模型对照组比较差异具有显著性（P＜0.05，P＜0.01），提示： 痛经停贴膏剂能升高痛经模型大鼠的6-keto-PGF1α含量，从而达到镇痛效果。

表2　痛经停贴膏剂对痛经大鼠血浆6-keto-PGF1α含量的影响

3　讨论

3.1实验性痛经模型的选择

近年来用于制备痛经模型的动物包括豚鼠、SD大鼠、Wistar大鼠、兔及小鼠，其中以Wistar大鼠使用率为最高。Wistar大鼠因性周期较其它动物稳定，故在研究原发性痛经的动物实验中常常被选用，本研究选取Wistar大鼠。

作者采用腹腔注射缩宫素引起子宫平滑肌痉挛性收缩这一较为公认的在体子宫痉挛（类痛经反应）的病理模型［3］。造模及动物处理参考林乔等［1］的方法，造模使用药物为戊酸雌二醇和缩宫素。戊酸雌二醇为天然雌二醇的戊酸盐，具有雌二醇的药理作用，可增强子宫收缩，提高子宫的敏感性。缩宫素为制备痛经模型时经常使用的致痛药物，不仅因为其可以直接作用于子宫肌细胞引起子宫收缩，而且还可以同时刺激子宫内膜细胞释放PGF2α引起痛经［4］。大鼠急性痛经模型制备周期有的为4 d，有的为10 d。有研究表明，大鼠急性痛经模型建立时间以10～15 d为宜［5］。故本研究采用了10 d方案以提高大鼠子宫的敏感度。

3.2痛经停贴膏剂镇痛作用与血浆PGI2水平

痛经疼痛严重影响患者的学习、工作和生活，因此止痛成为首要任务。本实验中作者在给大鼠戊酸雌二醇溶液灌胃后， 腹腔注射缩宫素， 大鼠出现扭体反应，这是大鼠子宫平滑肌痉挛、疼痛的外在反应和客观评价方法之一，扭体潜伏期和扭体次数能够客观反应大鼠给予缩宫素后所致痛经的情况。

近年来的研究认为，原发性痛经的发病与前列腺素（PG）密切相关。PG在体内合成中有多种代谢物，目前认为与疼痛有关的主要是PGF2α、PGE2、PGI2、TXA2［6］。PGF2α可使子宫张力升高，子宫过度收缩甚至痉挛性收缩而导致痛经。TXA2主要来自血小板，有较强的子宫收缩作用，强力促进血小板凝聚及血栓形成。PGE2可松驰子宫平滑肌。PGI2是一个强有力的血小板聚集抑制剂和血管扩张剂，它可涉及子宫血流动力学的调控，降低PGF2α诱导的肌紧张度。同时PGI2和TXA2是一对既相互拮抗又相互调节的前列腺素，特别是对血管舒缩或血小板聚散活性有强烈的调控作用。血浆或组织中TXA2和PGl2平衡失调是造成血小板聚集， 血管痉挛收缩或血栓形成的原因之一。正常情况下， 血小板表面激活后产生的花生四烯酸在环氧合酶的作用下生成PGI2和TXA2， 二者在循环中的水平处于相对平衡状态， 共同调节机体微循环和血流动力学功能。鉴于实验经费所限， 本研究只选择PGI2作为观测指标。而PGI2在体内半衰期极短， 为2～3 min。由于PGI2的不稳定性， 目前还难以直接测定， 所以国内外均以测定其稳定无活性的代谢产物6-keto-PGF1α作为判断其浓度的指标综上所述，本实验采用较为公认的腹腔注射缩宫素引起大鼠类痛经反应的病理模型，评价了痛经停贴膏剂的镇痛作用，并初步探讨了其治疗痛经的作用机制。实验结果表明，痛经停贴膏剂中高剂量组能延长大鼠扭体反应潜伏期，高剂量组能减少大鼠扭体反应次数，能够明显提高大鼠血浆6-keto-PGF1α水平，说明痛经停贴膏剂可以抑制大鼠扭体反应，具有明显的镇痛作用，其镇痛作用机制可能与提高血浆PGI2水平有关。

［1］林乔， 陈建南， 赖小平， 等. 川芎提取物对实验性痛经的镇痛机制［J］. 中国实验方剂学杂志， 2011， 17（10）：161.

［2］中国畜牧兽医学会. 中国兽医针灸学［M］. 北京： 农业出版社， 1984：213.

［3］刘敏如， 谭万信. 中医妇产科学［M］. 北京： 人民卫生出版社， 2001：323.

［4］嵇波， 张露芬， 朱江， 等. 痛经模型建立和评价方法的思考［J］. 中国药理学通报， 2008， 24（6）：711.

［5］孙海燕， 曹永孝， 刘静， 等. 小鼠痛经模型的建立［J］. 中国药理学通报， 2002， 18（2）：233.

［6］傅金荣. 子宫内膜异位症致疼痛的研究概况［J］. 上海中医药杂志， 1997， （6）：16.

Evaluation on Analgesic Effect of Tongjingting Paste in Rats Model with Experimental Dysmenorrhea

LIU Jin， SUI Zai-yun， HOU Wen-jing
（Shandong Academy of Chinese Medicine， Jinan 250014， China）

ObjectiveTo evaluate the analgesic effect of tongjingting paste in rats model with experimental dysmenorrhea and to reveal its analgesic mechanism. MethodsThe experimental dysmenorrheal model in rats was induced with oxytocin. A writhing test was employed to evaluate the analgesic effects of tongjingting paste， which was designed into different doses， in animal subjects. The contents of 6-keto-PGF1α in the blood plasma were observed by ELISA assay. ResultsTongjingting paste has a significant analgesic effect on experimental dysmenorrheal model in rats. Latent period was delayed significantly， the number of writhing response was evidently decreased as well. Besides， 6-keto-PGF1¦Á were significantly increased in the treated groups. ConclusionTongjingting paste had a significant analgesic effect on experimental dysmenorrheal model in rats. Its analgesic mechanism may be mediated by regulating the plasma levels of 6-keto-PGF1α.

Tongjingting paste； Experimental dysmenorrheal； Writhing reaction； 6-keto-PGF1α； Rat

Q95-33

B

1674-5817（2015）02-0167-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.02.016

2014-06-30

山东省中医药科技发展计划项目（No. 2011-165）

刘瑾（1973-）， 女， 硕士， 副研究员， 主要从事中药复方药效作用机理及安全性评价工作。E-mail： jinanlj56@163.com

隋在云（1964-）， 女， 硕士， 研究员， 主要从事中药及其有效成分的药效物质基础研究及安全性评价工作。E-mail： zy_505@163.com