响应面法优化咖啡果皮可溶性膳食纤维提取工艺和功能特性研究

胡荣锁++周晶++董文江+赵建平++陆敏泉++宗迎

摘 要 研究旨在应用酶法提取咖啡果皮中膳食纤维，为高品质膳食纤维提取及产业化开发应用提供参考。单因素及响应面优化纤维素酶法提取咖啡果皮中可溶性膳食纤维的工艺条件，并对其功能特性进行分析。结果表明：纤维素酶法提取的最优提取工艺为：超纯水（V）∶咖啡果皮粉（m）=100 mL∶6 g，纤维素酶活添加量为22 FPU/mL，酶解温度40℃，酶解时间2 h，在此工艺条件制备可溶性膳食纤维得率为9.72%；其持水力为（35.72±0.33）g/g，溶胀力为（94.85±0.23）mL/g，结合水力为（26.97±0.54）g/g。

关键词 咖啡 ；果皮 ；可溶性膳食纤维 ；酶法提取

分类号 TS273

Coffee Peel Soluble Dietary Fiber Extraction Technology

via Response Surface Methodology Optimization

and Functional Characteristics Analysis

HU Rongsuo1，3） ZHOU Jing2） DONG Wenjiang1，3）

ZHAO Jianping1，3） LU Minquan1，3） ZONG Ying1，3）

（1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533， China；

2 Institute of Tropical Bioseience and Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China；

3 Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture， Wanning， Hainan 571533， China）

Abstract The aim of enzymatic method extract coffee peel soluble dietary fiber was to provide reference of high quality dietary fiber industrialization development. Single factor and response surface methodology as an approach to optimize the extraction technology of coffee peel soluble dietary fiber， while their functional characteristics were briefly analyzed. The results showed that： the optimum extraction process of cellulase extraction was as follows： ultrapure water （V）∶coffee peel powder （m） =100 mL∶6 g， cellulose enzyme activity adding amount was 22 FPU/mL， enzyme solution temperature was 40℃， enzyme solution time was 2 h， in this process condition the coffee peel soluble dietary fiber yield was 9.72 %. The functional characteristics was as follows： retention ability yield was （35.72±0.33） g/g， swelling force yield was （94.85±0.23） mL/g， bound moisture force yield was （26.97±0.54） g/g.

Keywords coffee ； peel ； soluble dietary fiber ； enzymatic method

膳食纤维（dietary fiber，DF）是一类不为人体消化利用的非淀粉多糖，包括可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）两大类[1]。SDF具有比IDF更强的生理功能，如降血脂[2]、调节血糖[3]、预防结肠癌[4-5]、预防便秘、糖尿病[6]、调节机体免疫[7]和减肥[8]等，因此称之为人体必需的“第七营养素”。然而许多天然膳食纤维中SDF含量较低，无法达到高品质膳食纤维（SDF≥10%）的要求[9]。

云南省咖啡种植面积已突破12万hm2，年产副产物40万t以上，除少量作为肥料还田外，大量堆积废弃。既是资源的浪费，又会造成环境污染。对咖啡副产物综合利用研究，目前国内只见综述性论文发表[10]，而国外对咖啡副产物研究较为系统深入，咖啡果皮、咖啡渣、咖啡银皮、咖啡壳等均有涉猎。在膳食纤维方面仅有咖啡银皮研究，其水溶性膳食纤维含量达到总膳食纤维的86%，并将其应用到焙烤食品中[11]。

本研究利用响应面酶法提取咖啡果皮中的膳食纤维，酶法提取具有操作简单、条件温和、对环境破坏小、产品品质高的特点，是提取咖啡果皮膳食纤维最佳方式之一。并利用响应面法优化，以获得利用商用酶提取膳食纤维提取的最佳工艺条件，旨在为咖啡果皮高品质水溶性膳食纤维的产业化开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

云南小粒种咖啡果皮由云南农业大学热带作物学院协助收集。纤维素酶为Celluclast 1.5 L，自黑曲霉（Aspergillus niger）中提取，购自诺维信公司（Novozymes）公司，无水乙醇、盐酸、丙酮等均为分析纯，配制用水为超纯水。

1.1.2 主要仪器与设备

Master-s-plus UVF超纯水系统，上海和泰有限公司；XMTD-8222型水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；AL 104型电子天平，瑞士Mettler-Toledo公司；HB 10 digital型旋转蒸发仪，德国iKA公司；Z36HK型离心机，德国Hermle公司。

1.2 方法

1.2.1 原料的预处理

收集采用湿法加工的咖啡果皮，采用日晒法干燥，将咖啡果皮水分降至12%以下，保存备用。

提取前将咖啡果皮烘干至水分含量5%左右，粉碎，过20目筛，保存备用。

1.2.2 纤维素酶酶活测定

酶活测定采用滤纸酶活法检测纤维素酶总酶活，测定方法采用杜敏的方法[12]。

1.2.3 纤维素酶法提取可溶性膳食纤维

准确称取咖啡果皮粉，按一定料液比加入超纯水，加入一定量的纤维素酶后水浴提取，过滤，滤液真空浓缩至5～10 mL倒出，加水冲洗浓缩瓶，收集浓缩液和冲洗液，定容至10 mL，加入40 mL无水乙醇，静置沉淀1 h，抽滤，于80 ℃烘干滤渣，称重，计算得率[13]。

1.2.4 SDF得率计算

SDF得率（%）=[SDF质量（g）/咖啡果皮质量（g）]×100%

1.2.5 实验设计

单因素实验：固定其他条件，分别探讨料液比、酶用量、酶解温度和酶解时间对SDF提取得率的影响。各因素实验重复3次，取平均值。

结合单因素实验结果，根据BoX-Behnken实验设计原则，应用响应面法优化SDF提取条件。

1.2.6 膳食纤维的化学特性测定

1.2.6.1 持水力[14-15]

称取一定量SDF放入烧杯中，按1∶20 （质量体积比）比例加入去离子水，充分混匀，室温下静置24 h，在定量滤纸上沥干样品水分，并将其迅速转入表面皿中称重。按下式计算持水力：

持水力=[样品湿重（g）-样品干重（g）]/样品干重（g）

1.2.6.2 膨胀力[14-15]

称取一定量样品，按l∶20（质量体积比）比例加入去离子水，充分混匀，室温下放置24 h，读取量筒中液体样品的体积。按下式计算膨胀力：

膨胀力=[溶胀后纤维体积（mL）-干品体积（mL）]/样品干重（g）

1.2.6.3 结合水力[14，16]

称取一定量SDF放入烧杯中，按1∶20（质量体积比）比例加入去离子水，充分混匀，室温下静置24 h，在定量滤纸上沥干样品水分，将湿样移入离心管中，在6 000 r/min 条件下离心5 min 后弃去水分，所获得湿样所含水分即为结合水，其与干样的重量之比即为结合水力。按下式计算结合水力：

结合水力=[离心后样品湿重（g）-样品干重（g）]/样品干重（g）

1.2.7 数据统计分析

采用DPS软件对单因素实验结果进行显著性分析。应用Design Expert 8.0.5软件的BoX-Behnken实验设计建立数学模型，并进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 纤维素酶总酶活测定

葡萄糖溶液标准曲线见图1。

Celluclast 1.5 L为商用复合纤维素酶，含有内切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CBH）和纤维素二糖酶（BG）等多种成分，其酶活未知，因此测定其总酶活，即滤纸酶活（Filter paper activity，简称FPA）。采用Ghose方法[17-19]，进行酶活检测。

葡萄糖标准曲线见图1，其线性回归方程y=0.217 8X-0.017 5，R2=0.997 0，由此可知葡萄糖质量为2.0 mg时的吸光度值为0.418 4。

使用纸条纤维酶法检测，滤纸酶活检测曲线见图2，其线性回归方程y=0.863 5X+0.252 9，葡萄糖生成2.0 mg时，酶浓度为1.980 mL/L。带入公式（FPA=0.185/生产2 mg葡萄糖时酶浓度）[20]，得出纤维素酶Celluclast 1.5 L在自然pH值，50℃下的滤纸酶活为93.4 FPU/mL。

2.2 SDF提取单因素实验

为了提高响应面实验准确性，按实验方法中所述进行单因素实验，结果见表1。

由表1可知，料液比在0.5（即1∶20）、酶解温度50℃和酶解时间3 h时SDF得率有最大值，虽然随着酶活添加量的增加SDF增加，但在30 FPU/mL之后增加幅度小，因此酶活添加量选择30 FPU/mL和其它3个最大值作为响应面分析零点，进行下一步分析。

2.3 SDF提取的响应面优化

2.3.1 响应面实验因素水平的选取及结果

结合单因素实验结果，以料液比（A）、纤维素酶活添加量（B）、酶解温度（C）、酶解时间（D）为自变量，SDF提取率（Y）为响应值，设计四因素三水平的二次回归方程拟合自变量和SDF得率之间的函数关系。各实验因素与水平见表2，响应面实验设计及结果见表3。

2.3.2 模型的建立和显著性检验

利用Design Expert软件对表2中的结果进行多元回归拟合，得到SDF得率对纤维素酶活添加量、pH值、超声温度、超声时间的回归模型：

Y=9.37+0.13A-0.19B-0.084C+0.092D-0.34AB-0.52AC-0.16AD+0.035BC+0.21BD+0.49CD-0.85A2-0.49B2-0.26C2-0.13D2

响应面实验结果方差分析见表4。

模型的方差分析（表3）表明，失拟项不显著（p=0.208 8>0.05），而模型p<0.01，模型差异高度显著，模型确定系数R2=0.847 5，调整确定系数Adj R2=0.695 0，表明模型能较好地反映各因素与响应值的变化关系，可用于预测实际SDF的提取率。在α=0.05显著水平上剔除不显著项，得到简化方程：

Y=9.37-0.52 AC+0.49 CD-0.85 A2-0.49 B2

2.4 主效应分析

各因素的P值可以反映出各因素对实验指标的重要性，P值越小，表明该因素对实验结果影响越大[20]。由表3可知，4个实验因素对SDF提取率影响大小依次为酶活添加量>料液比>酶解时间>酶解温度。

2.4.1 单因素效应分析

回归方程中的4个因素任意3个固定在零水平，将实验因素分别固定在-1、-0.5、0、0.5、1五个水平，各因素不同水平的SDF提取率，并以此作图，结果见图3。

由图3可知，随自变量变化，各因素效应呈开口向下的抛物线状。在中心极值点处，咖啡果皮SDF提取率最高，偏离极值点SDF提取率下降，但下降幅度各异，其中A（料液比）下降最大，其次为B（酶活添加量），而D（酶解时间）下降最小。

2.4.2 两因素间交互效应分析

响应面及等高线图能够直观地反映出各个因素及其交互作用，利用Design Expert软件即可以作出两因素交互作用的响应面图及其等高线图，结果见图4。通过主效应分析可知酶解温度和酶解时间对SDF得率的影响较小，同时通过单因素效应分析可知两者对得率的影响小，且较为接近，因此两因素间交互效应分析不再进行酶解温度和酶解时间比较。

2.5 最优组合的确定及验证

利用Design Expert软件对模型求解，得到咖啡果皮中SDF最优提取条件：酶活添加量22.00 U/mL、料液比0.06、酶解时间2.00 h、酶解温度40.00℃，模型预测值为9.72%。为验证模型的适用性与可靠性，结合实际可操作性，在加酶量22.00 U/mL、料液比0.06、酶解时间2.00 h、酶解温度40.0℃进行验证性实验，所得SDF平均提取率为9.78%，与预测值基本相符。

2.6 膳食纤维功能特性研究

对咖啡果皮SDF持水力、膨胀力、结合水力能力进行功能检验，结果见表5。

由表5 可知，SDF 的持水力、膨胀力、结合水力能力都较好。说明SDF对于预防便秘和结肠癌的发生具有积极的作用。

3 讨论与结论

SDF提取方法较多，如物理法、化学法、酶法、化学酶法、物理酶法等，各方法均有优缺点。酶法反应条件温和，速度快，专一性强，所得SDF纯度高、无异味，因此酶法是工业化生产高品质SDF最佳提取方法之一。本实验所使用的为商用复合纤维素酶，该酶获得较易，价格便宜，操作性强，本实验所得的结论可为SDF工业化提取提供参考。

咖啡果皮SDF最佳得率达到9.72%，接近高品质SDF（≥10%）的要求。本实验仅对纤维素酶参数进行了验证，刘铭等[21]发现醇沉也会对SDF提取造成影响，小于6 h时SDF得率呈上升趋势；Zhang Juan[22]等用6种方法提取SDF，发现酶法提取得率（6.34%）相对于物理酶法（68.71%）等几种方法提取率低，因此本实验检测咖啡果皮SDF得率也并非最高得率。

对咖啡果皮SDF持水力、膨胀力、结合水力进行了初步研究，效果良好，说明该SDF具有良好的应用前景，但其最佳提取方法、组成和功能特性尚需进一步研究。

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