微酸环境响应的聚天冬氨酸修饰脂质体的制备与表征

王丽琳，沈骧一，苏海佳，曹辉



微酸环境响应的聚天冬氨酸修饰脂质体的制备与表征

王丽琳，沈骧一，苏海佳，曹辉

（北京化工大学北京市生物加工过程重点实验室，北京 100029）

利用带负电的聚天冬氨酸分子与部分带正电的磷脂双分子层之间的静电吸附作用，通过“一步法”成功制备了聚天冬氨酸（PASP）修饰脂质体（PLPs），实现了修饰脂质体微酸环境响应性。将脂质体制备与PASP修饰同时完成的“一步法”大大简化了制备工艺，提高了脂质体（PLPs）的制备效率。通过单因素筛选确定了pH敏感性显著的修饰脂质体制备条件，即外水相溶液PASP浓度2.5%（质量分数），pH8.5。透射电子显微镜照片显示PLPs由于修饰剂的存在具有更大的粒径，且表面电负性高，证明了“一步法”成功制备了pH敏感性修饰脂质体。

pH敏感；聚天冬氨酸；脂质体；制备；纳米粒子

引 言

肿瘤是一种极大危害人类健康的疾病。多年来人们一直致力于开发高效抗肿瘤药物，发现并推广使用了诸如羟基喜树碱[1]、紫杉醇[2]、莱菔硫烷[3]等新一代抗肿瘤药物。然而在研究中发现，多数药物分子为非选择性分子，进入人体后会广泛分布于各器官组织，在抑制肿瘤细胞的同时会抑制正常细胞的生长，引起病人的极大痛苦[4]。因此，针对传统给药方式存在的局限性，越来越多研究者着重于药物递送系统(drug delivery system)[5]的研究，包括口服药物释放系统、透皮药物释放系统、黏膜药物释放系统、靶向药物释放系统、细胞微囊化药物释放系统[6]等，其中，靶向药物释放系统能够有效地将药物运送至病变区[7]，降低给药剂量、避免抗肿瘤药物对正常组织的危害。脂质体是一种人工制备的生物膜类似物，由脂类双分子层组成，主要成分是磷脂和胆固醇，易与细胞膜融合并完成细胞内吞作用[8]，具有生物降解性和缓释性，可降低药物的毒性、提高药物的稳定性[9]，因此成为新型的药物载体广泛应用于抗肿瘤药物的靶向释放[10]。脂质体制备方法繁多，早期对于脂质体制备的摸索停留在改变有机相与水相接触方式以及蒸出方式上，形成了物理分散法、两相分散法等传统方法[11-12]。传统方法的优点是对设备要求低、制作方便；缺点是粒径和结构难以控制且难以规模化制备。随着研究的不断深入和人们对脂质体产品的需求增加，可制备出粒径可控、结构可控的脂质体的微流体法[13]、超临界流体法[14]等应运而生。目前脂质体作为抗肿瘤药物载体的主要研究目标是提高其靶向性和稳定性。为起到靶向治疗的目的，长循环脂质体[15]、温度敏感脂质体[16]、pH敏感脂质体[17]、磁性脂质体[18]、免疫脂质体[19]等新型脂质体被陆续研制出来。其中，pH敏感脂质体可通过在脂质体表面修饰具有pH响应性的分子得到[20]。肿瘤细胞生长于微酸性间质液中（pH约为5.0），用于制备肿瘤靶向药物载体的修饰分子必须可响应pH7.4～pH5.0的微弱酸性变化，这样才能达到药物在肿瘤组织中快速大量释放、在正常组织的生理环境中少量释放的目的。目前已有研究显示表面活性剂类物质[21]、聚丙烯酸及其衍生物[22]制备的修饰脂质体可以起到响应微酸环境的作用，但上述修饰分子自身生物相容性不高，容易对正常机体造成伤害。

聚天冬氨酸（PASP）是一种含有丰富—COO-基团的阴离子型生物大分子，pa=4.88，处于弱酸性环境中即可发生构象变化[23]。由于其具有良好的生物相容性、水溶性以及pH敏感性，在药物递送领域有着巨大的前景[24]。本文制备脂质体的主要成分大豆卵磷脂中含有相当一部分的磷脂酰胆碱，其头部的—N+基团带正电，理论上PASP可通过静电吸附作用自发组装到脂质体表面。若将PASP修饰于脂质体表面，当PASP修饰脂质体（PLPs）处于pH5.0左右的肿瘤组织病灶环境中，PASP会发生链收缩效应，扯断与之相连接的脂质体，造成药物释放，而当PLPs处于正常组织生理环境中时，PASP链维持舒展的构象，则PLPs结构保持完整，仅发生少量药物释放。长久以来，修饰脂质体的制备遵循“脂质体形成-脂质体修饰”两步进行，修饰过程需要经过1～2 h的水合过程[25]才能完成，制备效率不高。

本文将针对两步制备修饰脂质体工艺烦琐的问题，提出脂质体形成-修饰同时完成的一步制备法。该“一步法”用修饰剂PASP溶液代替复乳法中的外水相缓冲液，制备出响应弱酸性环境发生药物快速释放的脂质体。此外，考虑到PLPs的pH敏感性来源于PASP，因此外水相PASP溶液的浓度及pH必然会影响PLPs的pH敏感性，本文将研究影响pH敏感性的条件，以测试不同pH环境中的药物释放性能为手段，从而确定PASP修饰脂质体外水相PASP的最佳浓度及pH。

1 实 验

1.1 实验试剂与仪器

大豆卵磷脂（纯度≥98%），北京奥博星生物技术有限责任公司；胆固醇（纯度≥99%），北京奥博星生物技术有限责任公司；乙醚（分析纯）、NaCl（分析纯）、Na2HPO4(分析纯)、NaH2PO4（分析纯），北京化工厂；阿糖胞苷（分析纯），车头制药厂；硫酸鱼精蛋白（分析纯），Sigma；Triton X-100（10%），Sigma；本文实验中所述PASP皆为实验室自制。

电热恒温鼓风干燥箱，DHG-9076A型，上海精宏实验设备有限公司；水浴恒温磁力搅拌器，SHA-A，金坛市华峰仪器有限公司；全波长酶标仪，Thermo absystems，Multiskan Spectrum公司；旋转蒸发仪，RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂；高速离心机，TGL-16G，上海安亭科技仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 pH敏感脂质体的制备 “一步法”制备pH敏感脂质体，具体方法见文献[26]。

“分步法”制备pH敏感脂质体：精密称取卵磷脂48 mg，胆固醇12 mg，加入2.5 ml乙醚充分溶解。置于旋转蒸发仪0.02 MPa、25℃旋蒸30 min，注入阿糖胞苷水溶液1 ml，超声至形成乳液。加入2.5%（质量分数，下同）的PASP水溶液充分摇匀，30℃水合40 min，置于截留分子量3500的透析袋中透析除去未包封的小分子药物，即得[26]。

1.2.2 pH敏感脂质体的工艺优化 外水相PASP溶液浓度对修饰脂质体pH敏感性的影响。以“一步法”制备修饰脂质体，PASP溶液浓度为1.5%、2%、2.5%、3%。采用文献[26]所述反透析法测定pH敏感性以确定制备修饰脂质体的最佳PASP浓度。

外水相PASP溶液pH对修饰脂质体pH敏感性的影响。以“一步法”制备阿糖胞苷脂质体。PASP溶液pH分别为8.0、8.5、9.0、9.5。采用文献[26]所述反透析法测定pH敏感性以确定制备修饰脂质体的最佳外水相pH。

1.2.3 修饰脂质体的理化性质表征 修饰脂质体的透射电子显微镜观察。“一步法”制备LPs和PLPs：精密吸取制好的脂质体样品各10ml，以微量可调移液器小心滴加在铜网上，置于透射电镜下200 kV电压下观察。

修饰脂质体的表面电荷和粒度分析。“一步法”制备LPs、PLPs，并分别稀释成质量摩尔浓度为0.005 mol·kg-1的溶液，于激光粒度分布仪中测定zeta电位及粒度分布。

2 结果与讨论

2.1 pH敏感修饰脂质体的“一步法”制备方法

图1为利用“分步法”与“一步法”分别制备的PLPs在不同酸碱性环境中的药物释放曲线。由图所示，“分步法”制得的修饰脂质体在微酸环境中（pH=5.0）释放缓慢，在生理pH环境中（pH=7.4）释放快速，与微酸性响应的药物载体的要求相反，无法得到微酸性环境响应的PASP修饰脂质体。这可能是由于长链PASP难以与已经闭合为囊泡的磷脂头部发生静电吸附作用，pH敏感性的PASP分子无法与脂质体结合造成的。而“一步法”制备的PLPs在微酸性环境中（pH=5.0）6 h内释放完全，而相同时间内在正常生理环境下（pH=7.4）释放79.4%，实现了在微酸环境中快速释放的目的。这是因为“一步法”采用充分去质子化的PASP水溶液直接作为外水相，能够提供PASP中的电负性—COO-基团与正电性胆碱基团充分接触的机会。“一步法”保证了脂质体的形成和修饰过程一次性完成。PLPs的特点显示其具有成为肿瘤靶向药物载体的潜力。

2.2 修饰脂质体的pH敏感性优化

2.2.1 外水相溶液（PASP）浓度对修饰脂质体pH敏感性的影响 外水相PASP的浓度直接影响脂质体的修饰程度，从而改变pH敏感性和释放时间。由图2所示，外水相（PASP）浓度对PASP修饰脂质体的pH敏感性影响较大。在相同时间内（4 h），当外水相浓度为2.5%时，PLPs在pH5.0环境中药物释放超过85%，显著高于在pH7.4环境中52.4%的释放，这种释放量的差异性显著高于其他浓度PASP溶液制备的PLPs。PLPs对微酸环境的响应性取决于pH敏感性分子PASP在脂质体表面的实际修饰程度。当PASP溶液浓度低于2%时，PLPs中pH敏感性分子不足，无法表现出pH敏感性。当PASP浓度升高至3%时PLPs的pH敏感性回落，这是因为PASP浓度过高，聚合物PASP长链可能在溶液中形成折叠或螺旋构象，分子间也会产生位阻，不利于与脂质体静电吸附。因此，PLPs的pH敏感性与PASP的浓度并非线性关系，当PASP浓度为2.5%时，PLPs体现出最强的pH敏感性，如图3所示，此时PLPs在整个释放周期内pH敏感性显著，6 h内药物在微酸环境总释放完全而在正常生理环境中释放不超过60%，适于用作肿瘤靶向的药物载体。

2.2.2 外水相溶液（PASP）pH对修饰脂质体pH敏感性的影响 PASP能与脂质体静电吸附结合的先决条件是外水相溶液中的PASP能够电离出足够的电负性—COO-基团。为使弱电解质PASP充分解离出—COO-以便与磷脂分子的亲水头部静电吸附结合，实验中均调节外水相PASP的pH为碱性。由图4所示，当外水相pH为8.0～8.5时，PLPs表现出对于微酸性环境的pH敏感性，药物释放快速。说明当pH达到8.0及以上时，弱电解质PASP 已发生充分的电离。当外水相pH提高至9.0时PLPs在酸性环境和正常生理环境中的药物释放十分接近而不能满足pH敏感性药物载体的要求；将外水相溶液的碱性继续提高至pH9.5时，其pH敏感性甚至发生反转，可能是因为外水相中过量的碱加入会破坏脂质体囊泡的渗透压平衡，加速脂质体的作用而使pH敏感性失效。综上所述，仅当pH8.5时，PLPs有较好的pH敏感性，图5显示此时的PLPs在释放结束时pH5.0环境中药物累计释放率在90%以上，效果理想。

2.3 修饰脂质体的理化性质表征

2.3.1 修饰脂质体的形态观察 如图6所示，电镜下观察到LPs、PLPs皆分散良好，电镜下大致呈圆形。其中，普通脂质体直径约100 nm，而PLPs由于表面连接了高分子物质而使粒径增大至200 nm。透射电子显微照片从直观上论证了PASP分子可通过“一步法”有效修饰于脂质体表面。

2.3.2 修饰脂质体的表面电性与粒度分析 zeta电位能够反映胶体分散系的带电程度，还可以表示微粒的分散程度。LPs和PLPs的zeta电位和粒度分析测定值见表1。一般认为，zeta电位的绝对值在30 mV以上可以认为体系中微粒之间的作用以排斥力为主，不易聚沉。从表1中可以看出，LPs和PLPs 都是稳定的胶体体系。PASP链负电性基团丰富，因而PLPs的zeta电位值均高于LPs。表1显示的粒度分析变化趋势与zeta电位变化趋势相吻合，表明脂质体的理化性质与其表面是否具有修饰分子相关，再次证明了“一步法”制备pH敏感性修饰脂质体应用成功。

表1 两种脂质体的平均粒度与zeta电位Table 1 Mean size and zeta potential of two kinds of liposomes

3 结 论

本文成功运用“一步法”制备了pH敏感性显著的聚天冬氨酸修饰脂质体（PLPs）。实验结果表明，PLPs的pH敏感性强弱与PASP溶液浓度和pH有关，随PASP浓度和pH增大呈现先增加后减小趋势，当溶液浓度2.5%、pH为8.5时pH敏感性最佳。透射电镜下观察与粒度分布显示PLPs粒径高于LPs，同时zeta电位测试显示PLPs表面电负性强于LPs，两项理化性质测试表明“一步法”可以将电负性大分子PASP修饰于脂质体表面，成功制备了pH敏感性修饰脂质体。

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Preparation and characterization of subacid environment responsive polyaspartic acid modified liposomes

WANG Lilin，SHEN Xiangyi，SU Haijia，CAO Hui

Beijing Key Laboratory of BioprocessBeijing University of Chemical TechnologyBeijingChina

PASP modified liposomes (PLPs) were prepared by using negatively charged PASP chains linked to the head of positively charged phospholipidelectrostatic adsorption. A “one-step” method was developed to form and modify the liposomes. Single factor experiments were conducted to prepare high pH sensitive PLPs. The optimal formula in preparing PLPs was 2.5%(mass) PASP solution with pH8.5. TEM results showed that PASP modified liposomes had a larger particle size and their surface with higher electro-negativity. PASP modified liposomes are a kind of relatively stable emulsion system.

pH sensitivity；polyaspartic acid；liposomes；preparation；nanoparticles

2014-09-15.

Prof. SU Haijia, suhj@mail.buct.edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20141374

R 944.1

A

0438—1157（2015）03—1234—06

国家重点基础研究发展计划项目（2014CB745100）；国家高技术研究发展计划项目(2012AA021402)；教育部留学回国人员科研启动基金资助项目(LXJJ2012-001)。

2014-09-15收到初稿，2014-11-28收到修改稿。

联系人：苏海佳。第一作者：王丽琳（1989—），女，硕士研究生。

supported by the National Basic Research Program of China (2014CB745100), the National High Technology Research and Development Program of China (2012AA021402) and the Project-sponsored by SRF for ROCS, SEM (LXJJ2012-001).