红蓝荧光细胞的构建

王真，施新颜，陈宇

（杭州市妇产科医院　检验科，浙江　杭州　310008）

·技术与方法·

红蓝荧光细胞的构建

王真，施新颜，陈宇

（杭州市妇产科医院检验科，浙江杭州310008）

目的：构建人组蛋白H2B基因与蓝色荧光蛋白（BFP）融合的真核表达质粒，使其能在黑色素瘤细胞（B16细胞）中表达，形成在核区可以发出肉眼可见的蓝色荧光，胞质区发出肉眼可见红色荧光的双色荧光细胞。方法：采用普通PCR扩增得到BFP序列，通过反转录PCR（RT-PCR）从含有腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞（293细胞）中扩增获得H2B基因的部分cDNA序列。将BFP序列、H2B基因与pRetroX-Tight-Pur载体质粒来构建真核表达质粒（pRetroX-BFP-H2B），对其进行酶切并用普通PCR方法进行鉴定。采用脂质体转染技术将pRetroX-BFP-H2B重组质粒转染细胞质中能表达红色荧光蛋白（RFP）的B16细胞并观察融合蛋白的表达。结果：成功构建pRetroX-BFP-H2B质粒，经转染后的双荧光细胞可以呈现出双荧光的效果，转染后也能稳定地表达传代。结论：本研究为双色荧光细胞的构建及其荧光蛋白种类的选用提供了新的参考。

H2B基因；蓝色荧光蛋白；黑色素瘤细胞；真核表达质粒

荧光蛋白在生物感应器中的巨大应用潜力逐渐被开发出来。利用细胞结构组成信息开发出来的探针可以不断提高生物感应器的敏感度。目前利用荧光蛋白标记细胞核染色体并跟踪观察的技术已经比较成熟，荧光标记技术的成功标志着大部分的生物参数可以采用以荧光蛋白为基础的生物感应器进行测量。故本研究希望通过探索红蓝荧光细胞的构建，为细胞荧光定位设计提供新的思路。

1　材料和方法

1.1材料 pRetroX-Tight-Pur载体质粒、PAAV3质粒、黑色素瘤细胞（B16细胞）、人肾上皮细胞（293细胞）、H5α菌种（均由中国疾病控制中心病毒病所提供）；限制性内切酶Mlu1、EcoR1、BamH1，T4 DNA连接酶，Pyrobest DNA聚合酶，rTaq DNA聚合酶（均由TaKaRa公司提供）；质粒小提试剂盒（由天根生化科技有限公司提供）；普通DNA产物纯化试剂盒（由天根生化科技有限公司提供）；RNAisoTM Plus试剂盒（由TaKaRa公司提供）；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2（由TaKaRa公司提供）；胎牛血清（由杭州四季青生物工程材料有限公司提供）；Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM（由美国GIBCO/BRL公司提供）；氨苄青霉素（由上海生工生物工程技术服务有限公司提供）；LD12000 DNA Marker LD12000（由TaKaRa公司提供），核酸染料（由北京博润莱特科技有限公司提供）；溴酚蓝指示剂（由TaKaRa公司提供）。

1.2实验方法

1.2.1蓝色荧光蛋白（BFP）基因的提取与处理：①BFP基因的提取：摇床设置37 ℃ 220 r/min，挑取含PAAV3质粒（含BFP基因）的单克隆菌落置于2 mL LB液体培养基中，于摇床中振荡培养过夜，按照质粒小提试剂盒中说明书的方法提取该单克隆菌落中的PAAV3质粒。将提取后的PAAV3质粒进行普通PCR，以获得两端具有Mlu1与EcoR1两个酶切位点的BFP基因片段。获得目的条带大小应为742 bp，通过凝胶电泳观察其大小及亮度。引物序列为：

②BFP基因片段的酶切：通过普通PCR扩增获得的BFP的DNA片段，先用普通DNA产物纯化试剂盒将其纯化，然后在Mlu1和EcoR1双酶切作用下，置于37 ℃水浴中过夜。酶切结束后，通过凝胶电泳观察片段的亮度与大小。

1.2.2pRetroX-Tight-Pur载体质粒的提取：①pRetroX-Tight-Pur载体质粒的提取：设置摇床37 ℃220 r/min，挑取含pRetroX-Tight-Pur载体质粒的单克隆菌落于2 mL LB液体培养基中，置于摇床中振荡培养过夜，将菌液分装于4个EP管，按照质粒小提试剂盒说明书中的方法提取pRetroX-Tight-Pur载体质粒。载体质粒大小为6 568 bp，凝胶电泳观察其大小及亮度。②pRetroX-Tight-Pur载体质粒的酶切：由于该质粒中Mlu1和EcoR1的酶切位点相邻，所以先用MIu1酶切2 h后，经电泳鉴定已大致酶切完全，再加入EcoR1酶切，于37 ℃水浴中过夜。酶切后进行凝胶电泳，并观察载体质粒DNA的大小与亮度。

1.2.3BFP基因的插入：将酶切获得的BFP基因片段与pRetroX-Tight-Pur载体质粒分别用普通DNA产物纯化试剂盒纯化。然后通过对BFP基因片段与pRetroX-Tight-Pur载体质粒大小及相应浓度的估计，调整载体与目的片段的量使其在酶切与连接体系中的浓度比在1∶3～1∶10之间，使用T4连接酶于16 ℃水浴并对其连接过夜。

1.2.4pRetroX-BFP重组质粒的鉴定：①pRetroXBFP重组质粒转化入感受态细菌：将pRetroX-BFP重组质粒转化感受态大肠杆菌H5α。②单克隆菌落的挑取与培养：次日观察平板，发现长有约50～60株菌落，挑取10株形状规则的菌落分别置于含氨苄青霉素的2 mL LB液体培养基的试管中，并标记为1～10号，置于37 ℃ 220 r/min摇床上培养16 h。③pRetroX-BFP重组质粒的提取与鉴定：按照质粒小提试剂盒提取pRetroX-BFP重组质粒的DNA，取1 μL DNA稀释成30 μL溶液进行普通PCR鉴定，产物经凝胶电泳后观察，挑选阳性株。④重组子的酶切鉴定：将各管提取的质粒溶液置于37 ℃水浴中，并用MIu1 和EcoR1双酶切2.5 h，再进行电泳观察其酶切结果。根据普通PCR和酶切结果的鉴定，挑选质粒重组成功的菌株，将该菌种与含60%甘油的冻存液600 μL 以1∶1的比例保种。

1.2.5人组蛋白H2B基因的cDNA制备：①B16细胞RNA的提取：按照RNAisoTM Plus试剂盒说明书中的方法提取B16细胞中的总RNA，室温干燥沉淀2～5 min（不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解），加入适量的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后置于-80 ℃冰箱保存。②H2B核定位信号的cDNA制备：采用PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver 2试剂盒将以上提取的总RNA进行反转录PCR（RT-PCR），引物序列为：

RT-PCR结束后，采用普通DNA产物纯化试剂盒纯化DNA片段，获得的基因两端酶切位点为Mlu1与BamH1，取2 μL进行电泳并观察结果，获得目的基因大小应为400 bp左右，浓度约为10 ng/μL。取约2 μg纯化后的H2B DNA片段，在37 ℃水浴中用Mlu1 和BamH1双酶切过夜，通过凝胶电泳观察酶切后DNA片段的亮度。

1.2.6pRetroX-BFP-H2B重组质粒的制备：①pRetroXBFP载体质粒的酶切处理：取约2 μg已构建的pRetroXBFP载体质粒，在37 ℃水浴中用Mlu1和BamH1双酶切过夜。用普通DNA产物纯化试剂盒对酶切后的pRetroX-BFP载体质粒进行纯化，再取2 μL纯化后质粒进行凝胶电泳并观察质粒亮度。②pRetroX-BFPH2B重组质粒的制备：根据凝胶电泳中的质粒亮度估算质粒浓度，调整载体质粒与H2B DNA片段在酶切与连接体系中的终浓度比。为能得到较好的重组结果，将酶切后得到的H2B cDNA与BFP-pRetroX在20 ℃水浴中连接2.5 h。

1.2.7pRetroX-BFP-H2B重组质粒的鉴定：①单克隆挑取与鉴定：将重组子转化入感受态细胞，并均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB平板培养基，在37 ℃的培养箱中培养过夜。次日观察，菌落约70个。挑取9个菌落于含有氨苄青霉素的LB液体培养基，并分别标号1～9号，置于37 ℃ 220 r/min的摇床培养3.5 h。分别吸取2 μL菌液进行普通PCR反应进行鉴定，并以等量的ddH2O与H2B cDNA作对照，再通过凝胶电泳观察结果。②酶切鉴定：将凝胶电泳中条带明亮清晰的菌株，加入含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于37 ℃ 220 r/min的摇床培养过夜。将培养过夜的菌液用质粒小提试剂盒提取DNA质粒，加入EcoR1与BamH1酶于37 ℃水浴1.5 h，同时用pRetroX-BFP作为对照，酶切结束后通过凝胶电泳观察结果。

1.2.8pRetroX-BFP-H2B重组质粒的大量制备：采用QIANGEN质粒提取试剂盒并按照其说明书中的方法大量制备pRetroX-BFP-H2B重组质粒，提取获得的质粒经分光光度计测值后得到的数据为：浓度为0.078 μg/μL，260/280=1.82，260/230=2.05。

1.2.9转染：选用细胞质中能表达红色荧光蛋白（RFP）的B16细胞，采用脂质体法将pRetroX-BFPH2B重组质粒转染至B16细胞中。

1.2.10嘌呤霉素筛选培养基的配置：取嘌呤霉素盐酸盐（规格为25 mg），用5 mL去离子水完全溶解后过滤除菌，分装至EP管。取200 μL嘌呤霉素盐酸盐溶液，加含10%胎牛血清的DMEM培养基配置成筛选培养基母液1 mL，浓度为1.0 mg/mL。取3只EP管中各加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基，再分别加入1.0 mg/mL的培养基母液10、15和20 μL，配成嘌呤霉素终浓度为1.0、1.5和2.0 μg/mL的筛选培养基，用于质粒转染细胞的筛选。

1.2.11质粒转染细胞的筛选：用1.0、1.5和2.0 μg/mL的3个浓度的培养基分别培养被质粒转染的细胞，在第10～第15天内细胞全部死亡的最低浓度为1.0 μg/mL，选择该浓度为筛选培养基。当细胞大量死亡时撤去筛选培养基改用普通培养基培养。筛选培养期间定期用荧光显微镜观察细胞的荧光效果。

2　结果

2.1pRetroX-BFP-H2B重组质粒转染B16细胞的荧光激发结果 B16细胞经pRetroX-BFP-H2B重组质粒转染72 h以后，在荧光显微镜下观察其结果。如图1所示，在紫光激发下，对照组细胞（pRetroX-BFPH2B重组质粒未转染B16细胞）中有隐约的红色荧光，实验组细胞（pRetroX-BFP-H2B重组质粒转染B16细胞）中可以观察到蓝色荧光与暗红色荧光。

图1　pRetroX-BFP-H2B重组质粒转染B16细胞72 h后的荧光激发图（×400）

用1.0 μg/mL的嘌呤霉素筛选培养基筛选对照组细胞和实验组细胞6 d后，在荧光显微镜下用紫光及绿光激发并观察其结果。如图2所示，在紫光激发下，对照组细胞中有较多细胞死亡，大多数死亡细胞呈球形漂浮于培养基中并无蓝色荧光，少部分细胞仍表现非特异性红色荧光。实验组细胞中可以观察到大多数细胞的胞浆呈非特异性红色荧光，细胞轮廓与形态清晰可见，而其中央区域则呈圆点状的蓝色荧光。在绿光激发下，对照组细胞中的死亡细胞依然能够呈现红色荧光，实验组细胞能呈现强红色荧光，与紫光激发下的荧光效果对比强烈。

2.2各质粒转染细胞不同时间长度的荧光结果 对照组细胞分别为：pRetroX-BFP-H2B重组质粒转染B16（不含RFP）细胞、pRetroX-BFP-H2B重组质粒转染293细胞和PAAV2-EGFP表达载体转染293细胞。如图3所示，pRetroX-BFP-H2B重组质粒转染B16（不含RFP）细胞24 h，基本不可见荧光的激发，pRetroXBFP-H2B重组质粒转染B16（不含RFP）细胞96 h，已可见视野中有数量不少的蓝色荧光，但亮度微弱。与pRetroX-BFP-H2B重组质粒转染293细胞24 h和PAAV2-EGFP载体质粒转染293细胞24 h作为阳性对照相比，pRetroX-BFP-H2B重组质粒转染BFP在细菌中的表达量较差。

图2　嘌呤霉素筛选细胞6 d后的荧光激发图（×400）

图3　各质粒转染细胞不同时间长度的荧光激发图（×400）

3　讨论

荧光蛋白如绿色荧光蛋白（GFP）、增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、增强型黄色荧光蛋白（EYFP）等的荧光效果好，在生物学研究中的采用都较为广泛，而BFP的荧光亮度普遍都比较低，要求的激发光条件又比较高，因此其在生物学研究中的应用比较少。本研究中选取的荧光蛋白为BFP和RFP，一是运用红色荧光与蓝色荧光的颜色有较大的反差，以及两者在对方激发光源下的非特异性激发效果低，方便对比观察；二是BFP在标记上的应用较少。通过本研究可以进一步了解BFP在实际应用中的情况。

通过将转染成功的细胞在荧光显微镜下观察，可以见到蓝色荧光在细胞质中呈圆点状分布，从而可以确定BFP和H2B基因已重组入表达载体，但是BFP是否只在细胞核内表达仍需进一步实验确定。通过10多天的转染、细胞的筛选培养及观察，得到真核表达载体能整合入真核细胞的染色体组中并形成稳定转染，其重组后的基因并不容易随着细胞的传代而丢失。但是BFP荧光强度较弱，如何提高BFP的表达量或改善BFP的荧光强度并使其在科研中被更为广泛的应用是目前所必须解决的问题。

本研究将H2B融合BFP基因入核来构建细胞质与细胞核表达不同颜色的双色荧光蛋白细胞。该双荧光细胞可以呈现出双荧光的效果，转染后也能稳定地表达传代，为细胞质细胞核双染色在细胞的生理、病理形态学变化观察提供了一定的可借鉴方法，并为双荧光细胞的构建以及其荧光蛋白种类的选用提供了新的参考，为今后成熟地选用荧光蛋白标记与荧光蛋白的定位做了初步的探索和准备。

［1］Wiesmeijer KI， Krouwels IM， Tanke HJ， et al. Chromatin movement visualized with photoactivable GFP-labeled histone H4［J］. Differentiation， 2008， 76（1）: 83-90.

［2］翁丛丛， 方益民， 黄润巧， 等. 大肠杆菌不同SOD调控序列红色荧光蛋白报告基因载体的构建及功能鉴定［J］. 温州医学院学报， 2012， 42（1）： 48-52.

［3］López-Piñón MJ， Insua A， Méndez J. Chromosome analysis and mapping of ribosomal genes by one-and two-color fluorescent in situ hybridization in Hinnites distortus［J］. J Hered，2005， 96（1）: 52-58.

［4］周鸣， 李小玲， 李桂源. 蛋白质入核转运的机制和研究进展［J］. 中国生物化学与分子生物学报， 2006， 22（10）： 780-786.

［5］Mosammaparast NI， Jackson KR， Guo Y， et al. Nuclear import of histone H2A and H2B is mediated by a network of karyopherins［J］. J Cell Biol， 2001， 153（2）: 251-262.

［6］徐远久， 熊异平， 吴建敏， 等. 人类pEGFP/H2B真核表达质粒的构建及表达［J］. 重庆医科大学学报， 2009， 34（8）：1060-1062.

［7］李文林， 苏娟， 陶欣荣， 等. 白蛋白/细胞角蛋白19启动子调控的红绿双色荧光蛋白报告载体的构建及其在肝干细胞分化研究中的应用［J］. 第二军医大学学报， 2005（3）： 237-239.

［8］Teerawanichpan P， Hoffman T， Ashe P， et al. Investigations of combinations of mutations in the jellyfish green fluorescent protein （GFP） that afford brighter fluorescence， and use of a version （VisGreen） in plant， bacterial， and animal cells ［J］. Biochim Biophys Acta， 2007， 1770（9）: 1360-1368.

［9］Nguyen KD， Au-Young SH， Nodwell JR. Monomeric red fluorescent protein as a reporter for macromolecular localization in Streptomyces coelicolor［J］. Plasmid， 2007， 58（2）: 167-173.

［10］ 赵艳华. 红色荧光蛋白的改造与超分辨显微成像技术的改进［D］. 长沙： 湖南大学， 2013.

［11］ 王志芳， 安建梅， 孔建强. 含DsRed类似生色团的红色荧光蛋白的发展及应用［J］. 中国生物化学与分子生物学报，2013， 29（3）： 197-206.

［12］ 王盛， 陈典华， 蒋驰洲， 等. 基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针的构建及应用［J］. 中国细胞生物学学报， 2012，34（12）： 1258-1267.

［13］ 王锋， 张春雨， 万里川， 等. 光激活荧光蛋白及其在植物分子细胞生物学研究中的应用［J］. 植物学报， 2010， 45（5）：530-540.

［14］ 杨杰， 张智红， 骆清铭. 荧光蛋白研究进展［J］. 生物物理学报， 2010， 26（11）： 1025-1035.

［15］ 邓超， 黄大昉， 宋福平. 绿色荧光蛋白及其应用［J］. 中国生物工程杂志， 2011， 31（1）： 96-102.

［16］ 高必达， 钟杰， 赵慧茹. 荧光蛋白报告基因在植物寄生真菌研究中的应用［J］. 生物技术通报， 2011（9）： 32-43.

［17］ Morozova KS， Piatkevich KD， Gould TJ， et al. Far-red fluorescent protein excitable with red lasers for flow cytometry andsuperresolution STED nanoscopy［J］. Biophys J， 2010，99: L13-15.

［18］ Piatkevich KD， Hulit J， Subach OM， et al. Monomeric red fluorescent proteins with a large stokes shift［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2010， 107: 5369-5374.

［19］ Horikawa K， Yamada Y， Matsuda T， et al. Spontaneous network activity visualized by ultrasensitive Ca2+indicators，yellow Cameleon-Nano［J］. Nat Methods， 2010， 7（9）: 729-732.

［20］ Ivashkin PE， Lukyanov KA， Lukyanov S， et al. A synthetic GFP-like chromophore undergoes base-catalyzed autoxidation into acylimine red form［J］. J Org Chem， 2011， 76（8）: 2782-2791.

［21］ Subach FV， Malashkevich VN， Zencheck WD， et al. Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2009， 106（50）: 21097-21102.

［22］ Chica RA， Moore MM， Allen BD， et al. Generation of longer emission wavelength red fluorescent proteins using computationally designed libraries［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2010， 107（47）: 20257-20262.

（本文编辑：吴昔昔）

Construction of red and blue fluorescent cells

WANG Zhen， SHI Xinyan， CHEN Yu. Department of Clinical Laboratory， Hangzhou Women’s Hospital， Hangzhou， 310008

Objective: To construct the eukaryotic expression plasmid of BFP-H2B and express it in the B16 mouse melanoma cells which can already express red fluorescence protein （RFP） in the cytoplasm， and make the cells’ nucleus show blue light while the plasmid show red light when activated by suitable light wave. Methods: The blue fluorescence protein （BFP） was acquired with PCR from a constructed PAAV3， and H2B gene was obtained with RT-PCR from cultured 293 cell’s total RNA. The sequence encoding H2B and the sequence encoding BFP were inserted into pRetroX to construct the eukaryotic expression vector pRetroX-BFP-H2B. After the constructed plasmid was confirmed by enzymatic digestion and PCR digestion， the recombination plasmid was transfected into B16 mouse melanoma cells which could already express RFP in the cytoplasm by the lipofectamine transfection technology for observation of the fusion protein’s expression. Results: The transfection of double fluorescent cells could present a double fluorescent effect， and stably expresssd batches after successfully constructed the eukaryotic expression plasmid of BFP-H2B. It provided a new reference for the construction of double fluorescent cells and the selection of the fluorescent protein species. Conclusion: In this study we establish an available survey system for the study of the two color fluorescence cells and the selection of fluorescence proteins used.

gene H2B； blue fluorescence protein； melanoma cells； eukaryotic expression plasmid

Q78

B DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.12.009

2014-12-15

王真（1985-），女，山东日照人，检验师，硕士。