基于线粒体DNA控制区的新疆北鲵种群遗传多样性分析

袁 亮,李伟业,叶小芳,王秀玲*

(1.新疆师范大学 生命科学学院,新疆特殊环境物种多样性应用与调控重点实验室,新疆乌鲁木齐830054;2.广东省昆虫研究所,广东广州510260)

基于线粒体DNA控制区的新疆北鲵种群遗传多样性分析

袁 亮1,李伟业2,叶小芳1,王秀玲1*

(1.新疆师范大学 生命科学学院,新疆特殊环境物种多样性应用与调控重点实验室,新疆乌鲁木齐830054;2.广东省昆虫研究所,广东广州510260)

以线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)控制区为分子标记,对分布于新疆温泉县6处自然栖息地的新疆北鲵(Ranodon sibiricus)遗传多样性进行研究.共采集新疆北鲵尾端肌肉组织样本60份,通过PCR扩增获得853 bp的mtDNA序列,含D-loop序列747 bp、tRNA-Pro序列72 bp及部分tRNA-Thr和tRNA-Pro之间基因间隔区(ISR)序列34 bp,其中D-loop序列中A、T、G和C 4种核昔酸所占百分比分别为31.92%,35.04%,15.02%和18.02%,A+T所占百分比为66.96%.经MEGA软件比对发现,所得60个样品的扩增序列(853 bp)完全一致,共享一个单倍型,所有扩增序列仅在控制区的第449位碱基(均为A)与GenBank(AJ419960)中新疆北鲵线粒体该位点碱基(为G)不一致.结果表明,国内现存6处自然栖息地内的新疆北鲵遗传多样性极低,在近缘同属种及脊椎动物中都极为罕见,显示该种近期经历过严重的瓶颈效应,可能由一个单倍型扩散至目前的分布格局.研究结果可为该物种保护提供分子遗传学依据.

新疆北鲵;线粒体DNA;D-loop;遗传多样性

新疆北鲵(Ranodon sibiricus),或称为西伯利亚鲵、中亚北鲵,隶属两栖纲,有尾目,小鲵科,北鲵属,是中亚地区唯一的有尾两栖动物,只分布于东经80°和北纬45°为交点的周边500 km2的狭窄范围内[1].目前,该物种分布在中国新疆温泉县与哈萨克斯坦接壤的阿拉套山及别珍套山形成的山谷地带,我国境内仅发现6处自然栖息地(图1),海拔介于2 100～3 200 m,栖息地由地下涌泉形成的山间湿地、小溪及高山湖泊等形成.新疆北鲵保留了许多小鲵科原始的生物学特征,如:内鼻孔之间具犁骨齿、颌骨顶端有前囱门[2];染色体数目多(2n=66)、核型不对称、较多微小染色体[3];基于线粒体DNA(mitochondrial DNA, mt DNA)进化分析显示,新疆北鲵是小鲵科中较原始的类群之一[4],在小鲵科分类、系统演化等方面具有重要学术研究价值[5].

近20年,受盗捕、放牧、突发性自然灾害及全球气候变化等影响,我国新疆北鲵种群数量已不足3 000尾[6].1996年世界自然保护联盟(IUCN)红皮书将该种列为“易危(vulnerable)”物种,2000年将其受危等级调高至“濒危(endangered)”;哈萨克斯坦濒危动物红皮书将该种列为“易危”物种;中国濒危动物红皮书(1998)和中国物种红色名录(2004)均将该种列为“极危(critically endangered)”物种.因此,针对该物种采取有效的保护措施迫在眉睫,遗传多样性研究对阐明濒危物种的遗传适应力并提出有效保护策略具有重要意义[7].

mt DNA呈母性遗传,无重组,且进化速率较快[8],被广泛应用于动物遗传结构研究,特别是mt DNA控制区(D-loop)由于不编码任何基因,其进化速率又是线粒体上其他区段的2.8～5倍[9-10],可将近期分歧谱系区分开来,是探讨种内遗传结构、种群差异与地理关系的有效遗传标记[11-13].本研究通过对我国6处自然栖息地的新疆北鲵mt DNA控制区序列的测定,分析其遗传多样性,以期为新疆北鲵的科学管理和保护提供分子遗传学依据.

图1 新疆北鲵在中国的地理分布Fig.1 Geographical distribution of R.sibiricus in China

1 材料与方法

1.1 材 料

从新疆北鲵6处自然栖息地采集到尾端肌肉组织样品60份,每个栖息地各10份(表1).采用非致死性法取样,即捕捉到个体后,剪取尾端肌肉组织约1 cm,用酒精消毒后放生,所得组织样品保存于体积分数为95%的酒精中,置于冰盒中带回实验室备用.

1.2 DNA组提取及目的基因扩增

取30 mg组织样品放入匀浆器中匀浆,进行预处理.用动物组织基因组DNA提取试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)提取DNA组,操作过程按试剂盒说明书进行.对提取DNA用质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳检测.根据GenBank中新疆北鲵mtDNA全序列(登录号:AJ419960)[14]设计引物.上游引物R.S. D-loop(F)序列为:5′-ACTTACCAGGCTCCACCACTTACTT-3′,位于t RNA-Pro序列和tRNA-Thr序列之间的基因间隔区内,下游引物R.S.D-loop(R)为mt DNA控制区3′末端的29个碱基,其序列为:5′-TAAGGCTATAGTTACAGTATATACTATAA-3′(图2).

图2 引物在mtDNA上的位置Fig.2 Location of primers in the mtDNA

表1 肌肉组织样品采集信息Tab.1 Information of muscle tissue sampling

PCR扩增反应体系为50μL,其中含:Taq酶2.5 U,10×Taq缓冲液5μL,d NTPs(10 mmol/L)1μL,上下游引物(10 mmol/L)各2μL,DNA模板50 ng,加dd H2O至50μL.扩增反应在DL9700型PCR仪上完成,反应条件:95℃预变性4 min,每个循环包括94℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸50 s,扩增30个循环,最后一次循环结束后,72℃延伸10 min,4℃保存.得到的PCR产物经过电泳检测,使用DNA回收纯化试剂盒进行回收.

1.3 测序及序列分析

将回收纯化后的PCR产物直接测序,测序工作由北京鼎国昌盛生物技术有限公司完成.双向测序结果用Sequencher 4.2软件对位排序和拼接,辅以人工校对,去除杂峰,保留有效基因片段,使用MEGA 5软件对有效基因片段进行比对分析.

2 结 果

实验获得有效基因片段853 bp,包含D-loop序列、tRNA-Pro序列及部分tRNA-Pro和tRNA-Thr之间基因间隔区(ISR)序列,其中D-loop序列747 bp,A、T、G、C碱基所占百分比分别为31.92%, 35.04%,15.02%和18.02%,A+T所占百分比为66.96%,t RNA-Pro序列72 bp,tRNA-Thr和t RNAPro之间ISR序列34 bp;60个扩增基因之间比对,发现所有853 bp碱基位点及顺序完全一致,不存在任何变异位点,60个个体共享一个单倍型;所得853 bp有效基因片段与GenBank中来自苏鲁别珍栖息地同一物种相应基因序列比对,在D-loop区第449位碱基处有1个突变位点,60个扩增序列的该位点碱基均为A,而GenBank中新疆北鲵mtDNA该位点碱基为G,由此可见,位于我国温泉县境内的6个新疆北鲵种群之间的遗传多样性极低.

3 讨 论

现存小鲵科祖先大约起源于白垩纪中期(110百万年前)的中国北方,后向亚洲其他地方扩散,因青藏高原隆起和一系列造山运动,导致气候改变和亚洲内陆荒漠化,促使小鲵科动物分化并形成目前在亚洲的分布格局[4].现存的新疆北鲵已成为遗存于古北界、中亚亚界、蒙新区、天山山地亚区的孑遗物种[1],作为小鲵科系统进化中较原始的类群,理论上新疆北鲵应积累了丰富的遗传多样性,然而事实却让人出乎意料.张勇[15]曾对新疆北鲵4处栖息地21个样品(6个采自SL、6个采自JM、4个采自SE、5个采自AK,样品由本课题组提供)D-loop区的部分序列(667 bp)进行过分析,未发现有核昔酸突变位点;Chen等[16]对123个新疆北鲵样品(SL、JM、SE、SL1、SL2各采集20个样品,AK采集23个样品,样品由本课题组提供)的1 323 bp mt DNA序列比对后,仅在tRNA-Thr和tRNA-Pro之间ISR内发现4个核昔酸变异位点,定义了3个单倍型;本研究则对来自6处栖息地的60个新疆北鲵mt DNA 853 bp序列(主要含D-loop和tRNA-Pro)进行了比对分析,均未发现有多态性核昔酸变异位点.3个独立的研究,共涉及实验样品204份,样品已涵盖目前国内新疆北鲵所有6处自然栖息地,结果均表明,国内现存6处自然栖息地的新疆北鲵遗传多样性极低.

3.1 新疆北鲵遗传多样性如此单一在脊椎动物中极罕见

濒危物种由于受瓶颈效应、近交衰退作用,虽然可以预料其种群遗传多样性较低[17],但一般仍可在mtDNA控制区内发现一些变异位点.如张亚平等[18]对分布于大小凉山、邛崃、眠山等山系的40个大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)样本的mtDNA控制区进行分析,仍检出了5个变异位点,9个单倍型,平均每64 bp出现一个变异位点;柳杨等[19]对黄山短尾猴(Macaca thibetana)7个群体30个样本mtDNA控制区5′端493 bp分析后,也发现7个变异位点,定义了3种单倍型,平均每70 bp出现一个变异位点;陶峰勇等[20]对珠江、黄河和长江3个地理单元的28条大鲵(Aodrias davidiunus) mtDNA控制区的771 bp序列分析后,发现有64个多态性核昔酸变异位点,定义了27个单倍型.但像新疆北鲵mtDNA控制区遗传多样性如此之低的现象在近缘同属种乃至脊椎动物中极其罕见.

3.2 瓶颈效应导致新疆北鲵遗传多样性单一

新疆北鲵分布于海拔2 100～3 200 m,此海拔高度已基本是变温动物能够耐受的上限.距今约2.65万年至2万年的更新世末次盛冰期(Last Glacial Maximum,LGM)[21],天山-阿勒泰山区的部分冰川平衡线高度(equilibrium line altitude,ELA)就曾下降至海拔3 200～2 600 m[22],因此新疆北鲵目前分布区是冰川期冰川扩张可能延伸到达的区域,由此推测该物种的种群地理分布受冰川周期进退的影响较大[23].新疆北鲵种群遗传多样性极低,暗示该种曾经历过严重的种群灭绝过程(瓶颈效应),有1支群体(更极端情况是可能仅有1只雌性个体和1只或若干只雄性个体)得以幸存,随着气候环境逐渐改善,幸存新疆北鲵的种群数量得以恢复,并沿河流、溪流等迁徙通道向四周迁移扩撒,扩散出去的个体形成新的栖息地,并保留了现有分布格局.更新世以来冰川期周期变化(如LGM)成为影响新疆北鲵种群遗传多样性分化重要因素,由于此次瓶颈效应发生时间属历史上的近期事件,尚未有足够的时间形成遗传分化,导致了新疆北鲵遗传多样性单一.

3.3 新疆北鲵分布区域过窄及小种群与其遗传多样性的关系

新疆北鲵主分布区位于哈萨克斯坦,据报道有27处分布点[24],而我国只有6处自然栖息地.新疆北鲵仅在中哈界山——阿拉套山及分支山脉大约250 km长的区段内有分布,分布范围如此狭窄在脊椎动物中甚为罕见.由于分布区域过于狭小,又同属于一个山脉水系,真正意义上的地理隔离就不易形成,这可能是导致该种种群遗传结构单一的原因之一.同时,种群大小也可影响种群的遗传潜力,特别是有效种群数(effective population size,Ne),因为Ne与种群遗传变化、种群近交风险及种群遗传漂变都有很大关联性[25].近20年新疆北鲵种群数量持续减少,个别栖息地的种群已处于灭绝消失的边缘,长期维持这样一个低水平的种群数量,导致种内近交概率增大,遗传变异丧失,基因结构趋向同质化,是导致该物种遗传多样性单一的必然因素[26].

3.4 关于我国境内新疆北鲵视为同一个种群的讨论

新疆北鲵6处自然栖息地中2处(JM和SE)位于博尔塔拉河北岸的阿拉套山,4处(AK、SL、SL1及SL2)位于博尔塔拉河南岸的别珍套山.其中最远的两个栖息地(JM和SL2)之间距离约50 km,SL、SL1和SL2三处栖息地分布相对集中,最近距离不足5 km;最高(AK)和最低(SL)栖息地之间海拔落差1.1 km;各栖息地之间有山地、草场、半荒漠草地等相隔.表面看6处栖息地呈岛屿状分布,彼此孤立,因此在之前的保护工作中习惯将新疆北鲵6处自然栖息地称为6个种群.但从大的地理格局来看,6处栖息地都位于阿拉套山和别珍套山形成的山谷之间,源自或流经这6个栖息地的泉水或溪水最终都汇入了博尔塔拉河主河道,其中多数是以地表溪流或河流方式汇入博尔塔拉河,有的也因海拔落差渗入地下泥石暗道流入博尔塔拉河,因此6处栖息地应同属于博尔塔拉河上游水系.各栖息地与博尔塔拉河相连的这些地表溪流、河流及地下泥石暗道可被视为新疆北鲵的迁移通道,王秀玲等[1]曾观察到成体北鲵夏季觅食时可离开水域最远达11 m,因此不能排除新疆北鲵具有沿着这些通道迁移及逆流而上的能力.国内6处栖息地的新疆北鲵可被视为同一个种群,共享一个单倍型.

1989年新疆北鲵在我国被重新发现,但短短20余年间,多种因素导致该物种种群数量迅速下降,若不加强管理,该种在我国有灭绝的可能.根据国内新疆北鲵遗传多样性现状,提出3点保护对策和建议: 1)应将国内6处自然栖息地的新疆北鲵视为同一种群,并作为一个整体单元加以管理和保护,防止任何一个栖息地的群体灭绝;2)实行新疆北鲵的迁地保护工作,通过人工繁殖技术提高该物种的野生种群数量,同时注重其遗传多样性的保护;3)积极寻求与哈萨克斯坦动物学研究人员的合作,尽早将分布于哈萨克斯坦的新疆北鲵与国内分布种群进行遗传多样性比较,以便为该物种拟定更为合理的保护策略.

致谢:厦门大学生命科学学院王义权教授指导研究工作;新疆北鱿管理站杨俊宇站长对本研究样品采集给予了大力支持和帮助.

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Analysis of Population Genetic Diversity of Ramodomsibiricus in China Inferred from Mitochondrial DNA Control Region

XUAN Liang1,LI Wei-ye2,XE Xiao-fang1,WANG Xiu-ling1*
(1.Laboratory of Species Diversity Application and Control in Xinjiang,College of Life Science, Xinjiang Normal University,Urumqi 830054,China;2.Guangdong Entomological Institute,Guangzhou 510260,China)

The population genetic diversity of Siberian salamander(Ranodon sibiricus)in China was studied using mitochondrial DNA control region.A total of 60 samples were collected from R.sibiricus tail of six habitats in Wenquan County,the only distribution area of R.sibiricus in China.For each sample,genomic DNA was extracted and the fragment of the mitochondrial DNA controling region(plus upstream proline t RNA,part of intergenic spacer region(ISR)between threonine and proline tRNAs)was amplified via PCR after sequencing,we obtained 853 bp sequences including 34 bp of partial ISR,72 bp tRNA-Pro,and 747 bp mtDNA control region.The average base compositions of the control region were 31.92%,35.04%,15.02%,18.02%for A,T,G,C,respectively.After aligning the 60 sequences in MEGA software,we found that they were all identical and shared one haplotype,differing from the one retrieved from the GenBank(accession number,AJ419960)at the 449thsite of control region,with A in our 60 sequences and G in the retrieved sequence.This result demonstrates that the Siberian salamanders have extremely low levels of genetic diversity.This phenomenon is rare among the closely related species and other vertebrates.It further suggests that R.sibiricus had experienced a serious bottleneck effect in the relatively recent past;and the current distribution pattern might result from the spread of one haplotype.Therefore,the existing R.sibiricus in Xinjiang province of China should be considered as one geographic group for management and protection.

Ranodon sibiricus;mitochondrial DNA;D-loop;genetic diversity

10.6043/j.issn.0438-0479.2015.02.008

Q 349.1;Q 959.52

A

0438-0479(2015)02-0194-05

2014-10-09 录用日期:2014-11-11

新疆维吾尔自治区国际科技合作基金(20126009);新疆维吾尔自治区自然科学基金(2011211B17)

*通信作者:wxl_310@126.com

袁亮,李伟业,叶小芳,等.基于线粒体DNA控制区的新疆北鲵种群遗传多样性分析[J].厦门大学学报:自然科学版,2015,54(2):194-198.

:Xuan Liang,Li Weiye,Xe Xiaofang,et al.Analysis of population genetic diversity of Ranodonsibiricus in China inferred from mitochondrial DNA control region[J].Journal of Xiamen University:Natural Science,2015,54(2):194-198.(in Chinese)