特发性膜性肾病肾组织磷酯酶A2受体的检测及其临床意义

刘 红1,2,3 骆伟丽1,2,3 龚劭敏1,2,3 丁小强1,2,3

(1复旦大学附属中山医院肾内科 上海 200032;2上海市肾病与透析研究所 上海 200032; 3上海市肾脏疾病与血液净化重点实验室 上海 200032)

特发性膜性肾病肾组织磷酯酶A2受体的检测及其临床意义

刘 红1,2,3 骆伟丽1,2,3 龚劭敏1,2,3 丁小强1,2,3△

(1复旦大学附属中山医院肾内科 上海 200032;2上海市肾病与透析研究所 上海 200032;3上海市肾脏疾病与血液净化重点实验室 上海 200032)

目的 探讨特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)患者肾组织磷酯酶A2受体(phospholipase A2receptor,PLA2R)的检测情况并分析其临床意义。方法 回顾性分析101例经临床和肾脏病理确诊为IMN并随访1年以上的患者(在本单位肾活检前均未接受激素或免疫抑制剂治疗);13例临床和病理确诊为系统性红斑狼疮Ⅴ型、乙型肝炎、干燥综合征相关等继发性膜性肾病及20例非膜性肾病患者作为对照组。检测各组患者肾组织PLA2R及IgG分型的结果,并分析PLA2R阳性及阴性IMN患者治疗前后尿蛋白、肾功能的变化。结果 86.14%IMN患者肾组织PLA2R阳性,而继发性膜性肾病患者肾组织PLA2R阳性率仅为23.08%(vs.IMN组,P＜0.001)。83.75%IMN患者肾组织PLA2R阳性伴IgG4中度以上阳性;继发性膜性肾病患者中,无一例肾组织PLA2R阳性同时伴IgG4中度以上阳性(vs.IMN组,P＜0.01)。47例肾组织PLA2R阳性的IMN患者予激素或激素联合免疫抑制剂治疗,随访6个月以上,85.11%患者尿蛋白缓解,而9例肾组织PLA2R阴性的IMN患者尿蛋白缓解率只有30.0%(vs.IMN PLA2R阳性组,P＜0.01)。结论 IMN患者肾组织PLA2R阳性率高。肾组织PLA2R阳性伴IgG4中度以上阳性是鉴别IMN和继发性膜性肾病的重要指标。激素或/和免疫抑制剂可以更有效地降低肾组织PLA2R阳性IMN患者的蛋白尿。肾组织PLA2R阳性可能可以作为预测激素或免疫抑制剂治疗有效与否的重要指标。

磷酯酶A2受体; 特发性膜性肾病; 继发性膜性肾病; 蛋白尿

*This work was supported by the National Science and Technology Support Program(2011BA110B00)and the Research Project of Shanghai Committee on Science and Technology(14DZ2260200).

特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)是老年肾病综合征患者最常见的病理类型。随着对IMN发病机制的研究进展,目前认为IMN是一种自身免疫性疾病。但是长期以来一直未找到人IMN的自身抗原。2002年, Debiec等[1]鉴定出足细胞中的中性内肽酶(neutral endopeptidase,NEP)是导致膜性肾病的抗原,但这只能解释特定人群的IMN。2009年,美国学者提出肾组织中M型磷酯酶A2受体(phospholipase A2receptor,PLA2R)是IMN的致病抗原[2],约52%～81%的IMN患者血PLA2R抗体阳性[2-6],而肾组织中PLA2R的检测阳性率要高于血液检测的阳性率[7-9]。此外膜性肾病中IgG的沉积也有其特殊性,以IgG4沉积为主[9-10]。本研究回顾性分析IMN患者肾组织中PLA2R的阳性率,并结合IgG分型的检测,以期能早期正确诊断IMN,并探讨这些指标与患者临床表现及治疗的相关性。

资料和方法

研究对象 回顾性分析2010年1月至2012年 8月在复旦大学附属中山医院住院并接受肾活检的患者(均未接受激素或免疫抑制剂治疗),经临床和肾脏病理确诊为IMN并随访1年以上。临床和病理确诊为系统性红斑狼疮V型、乙型肝炎、干燥综合征等继发性膜性肾病及部分非膜性肾病患者作为对照组。

临床资料 所有患者签署知情同意书。收集患者住院肾活检时临床资料,包括性别、年龄、病程、血白蛋白、血清肌酐(Scr),MDRD公式计算的肾小球滤过率(eGFR),24 h尿蛋白定量。

肾组织病理检查 肾组织中IgG、Ig A、Ig M、C3、C4、C1q均采用冰冻切片直接免疫荧光检测。肾小球IgG亚型沉积检测(IgG1、IgG4采用直接荧光法检测):冰冻切片吹干,滴加FITC标记的一抗,分别为1:200稀释的兔抗人lgG1单抗(Sigma, F0767)、IgG4单抗(Sigma,F9890)孵育1 h后流水冲洗,吹干,甘油封片,荧光显微镜下观察结果。肾组织PLA2R检测:冰冻切片吹干,一抗为1:100稀释的兔抗人PLA2R1多抗(Sigma,HPA012657),室温避光孵育1 h,加1:50稀释的Alexa Fluor 488标记羊抗兔IgG抗体F(ab′)2片段(Molecular Probes,A11070)孵育1 h后流水冲洗,吹干,甘油封片,荧光显微镜观察,荧光强度判定:0阴性,1+为弱阳性,2+为中度阳性,3+为强阳性。

激素或免疫抑制剂治疗终点 尿蛋白缓解率包括尿蛋白完全缓解(24 h尿蛋白≤0.3 g/24 h)和部分缓解(24 h尿蛋白定量较基线下降≥50%,但绝对值＞0.3 g/24 h)。

结 果

病例选择 2010年1月至2012年12月,临床和病理确诊为IMN,且随访1年以上,资料完整的患者共101例,同期确诊为继发性膜性肾病且资料完整的13例(狼疮性肾炎Ⅴ型6例,干燥综合征相关1例,甲状腺炎相关1例,类风湿关节炎继发1例,乙肝相关2例,梅毒相关1例,IgG4相关1例)。另随机选择20例非膜性肾病患者(狼疮性肾炎Ⅳ型8例,局灶性节段性肾小球硬化6例,Ig A肾病2例,微小病变、硬化性肾炎、系膜增生性肾炎、狼疮性肾炎Ⅱ型各1例)。

肾组织PLA2R的检测 所有134例患者均行肾组织PLA2R检测(表1)。86.14%(87/101)IMN患者PLA2R阳性。继发性膜性肾病组中,3例(23.08%)患者肾组织PLA2R弱阳性(PLA2R 1+),分别为乙肝相关性膜性肾病、IgG4相关膜性肾病及狼疮性肾炎V型。

表1 各组患者肾组织PLA2 R检测结果Tab 1 PLA2 R glomerular deposits in different groups

IMN与继发性膜性肾病IgG亚型的检测 80例IMN患者和13例继发性膜性肾病患者行肾组织IgG1和IgG4检测。IMN患者中95.0%IgG1阳性,其中中度以上阳性率为82.5%。而继发性膜性肾病患者中84.62%IgG1阳性,其中61.54%为中度以上阳性,与IMN组相比差异无统计学意义。IMN患者中95.0%IgG4阳性,中度以上阳性率为90.0%,而继发性膜性肾病患者中30.77%IgG4阳性,其中只有1例(7.69%)乙肝相关膜性病变患者IgG4为中度阳性,与IMN组相比差异均有显著统计学意义(P＜0.01)。80例IMN患者中67例(83.75%)肾组织PLA2R阳性伴IgG4中度以上阳性,而继发性膜性肾病患者中无PLA2R阳性伴IgG4中度以上阳性者,两组相比差异有统计学意义(P＜0.01)。

肾组织PLA2R阳性与阴性IMN患者的临床情况比较 101例IMN患者中,87例肾组织PLA2R阳性,14例肾组织PLA2R阴性,两组患者入组时临床指标无差异(表2)。

表2 肾组织PLA2 R阳性和阴性IMN患者的临床情况比较Tab 2 Clinical characteristics of the IMN patients with or without PLA2 R glomerular deposits (±s)

表2 肾组织PLA2 R阳性和阴性IMN患者的临床情况比较Tab 2 Clinical characteristics of the IMN patients with or without PLA2 R glomerular deposits (±s)

Clinical characteristics PLA2 R positive (n=87) PLA2 R negative (n=14) Age(y) 52.8±16.95 55.0±15.41 Gender(male:female) 47:40 11:3 History(mo) 5.28±11.81 5.49±6.60 Serum albumin(g/L) 25.76±6.02 25.86±6.47 Scr(μmol/L) 74.27±25.75 81.36±13.01 eGFR(mL·min-1 ·1.73 m-2) 89.25±30.48 79.46±14.43 Proteinura(g/24 h) 5.24±3.32 5.03±3.07 Nephrotic syndrome [n(%)] 57(65.5%) 10(71.43%)

87例肾组织PLA2R阳性IMN患者中,50例治疗后随访6个月以上,平均随访(14.68±8.24)个月。其中3例予血管紧张素受体拮抗剂(angiotensin receptor blocker,ARB)治疗,47例予激素或激素联合免疫抑制剂治疗(39例予激素联合钙调磷酸酶抑制剂环抱素或FK506治疗,8例单予激素或激素联合雷公藤多甙治疗)。14例肾组织PLA2R阴性IMN患者中,10例治疗后随访6个月以上,平均随访(14.0±6.55)个月;1例予ARB治疗,8例予激素联合钙调磷酸酶抑制剂环抱素或FK506治疗,1例单予雷公藤多甙治疗。4例予ARB治疗的患者均无尿蛋白缓解,其中1例 PLA2R阴性患者随访2年时发现膀胱恶性肿瘤,患者进入终末期肾病行血液透析治疗。而两组予激素或激素联合免疫抑制剂治疗的患者,在治疗后平均24 h尿蛋白均显著下降,肾病综合征比例明显下降,血浆白蛋白水平升高,治疗前后肾功能水平无显著变化(表3)。47例PLA2R阳性IMN患者中,40例(85.11%)尿蛋白缓解,其中19例(40.43%)尿蛋白完全缓解,21例(44.68%)部分缓解,但2例在免疫抑制减量或撤药时尿蛋白复发。9例PLA2R阴性IMN患者中,3例(30.0%)尿蛋白缓解(vs.肾组织PLA2R阳性IMN组,P＜0.01),2例(22.22%)尿蛋白完全缓解,1例(11.11%)尿蛋白部分缓解,与PLA2R阳性IMN患者比较差异均无统计学意义。

讨 论

膜性肾病是导致肾病综合征的常见病因。其特点是患者体内抗体与肾小球基底膜上皮侧足细胞上抗原结合形成原位免疫复合物,激活补体,破坏肾小球滤过屏障的,从而产生大量蛋白尿。约25%的膜性肾病是继发性的,可以继发于狼疮性肾炎、恶性肿瘤、药物相关或由于病毒或细菌感染后[11-12]。只有排除了继发性的膜性肾病才可以确诊为IMN。原发性和继发性膜性肾病的治疗方法不同,许多原发性膜性肾病患者需要激素联合免疫抑制剂治疗,而继发性膜性肾病患者则主要是治疗原发疾病。因此区分原发性和继发性膜性肾病至关重要,直接与患者的治疗和预后相关。但是临床上,有时判断是原发性还是继发性膜性肾病是十分困难的,一些继发因素往往在出现膜性肾病数月甚至数年以后才发现。研究已证实PLA2R是IMN的标志性抗原,在IMN患者血中,抗PLA2R的抗体阳性率达52%～81%,是鉴别IMN和继发性膜性肾病的重要指标,并且已有研究证实,IMN患者肾组织PLA2R的阳性率高于血液PLA2R检测阳性率,一些血液PLA2R抗体阴性的IMN的患者,肾组织PLA2R染色仍呈阳性。我们通过回顾性分析发现,86.14%的IMN患者肾组织PLA2R阳性,在继发性膜性肾病患者中只有23.08%肾组织PLA2R阳性,而且都表现为PLA2R弱阳性。因此肾组织PLA2R阳性是区分IMN和继发性膜性肾病的良好指标,方便简单,较检测血液PLA2R抗体判断IMN更为敏感。此外,本研究结果显示,检测肾组织PLA2R同时结合IgG分型的检测可以更好地鉴别IMN和继发性膜性肾病。在我们研究中,83.75%IMN患者肾组织PLA2R阳性伴IgG4中度以上阳性,但继发性膜性肾病患者中均无PLA2R阳性伴IgG4中度以上阳性。2例肾组织PLA2R弱阳性的继发性膜性肾病患者(1例狼疮性肾炎Ⅴ型,1例IgG4相关膜性肾病)肾组织IgG4染色均为弱阳性,而1例HBV相关继发性膜性肾病患者,虽然IgG4中度阳性,但肾组织PLA2R阴性。因此即使肾组织PLA2R弱阳性的膜性肾病患者,若IgG4染色为阴性或弱阳性,诊断IMN时必须慎重,需积极寻找继发因素,并在随访中不断关注是否有继发膜性肾病的可能。单纯IgG4中度阳性亦不能排除继发性膜性肾病。

表3 肾组织PLA2 R阳性和阴性IMN患者予激素或激素联合免疫抑制剂治疗疗效比较Tab 3 Effects of steroids or steroids combined with immunosuppresants therapy in IMN patients with positive and negative glomerular PLA2 R (±s)

表3 肾组织PLA2 R阳性和阴性IMN患者予激素或激素联合免疫抑制剂治疗疗效比较Tab 3 Effects of steroids or steroids combined with immunosuppresants therapy in IMN patients with positive and negative glomerular PLA2 R (±s)

vs.pre-treatment,(1)P＜0.05;(2)P＜0.01.

PLA2 R neg PLA2 R positive ative PLA 2 R negative Pre-treatment (n=47) Prst-treatment (n=47) Prst-treatment (n=9) Pre-treatment (n=9) Age(y) 52.13±15.64 52.67±14.98 Gender(male:female) 24:23 7:2 History(mo) 4.20±7.22 5.99±7.85 Follow up time(mo) 15.07±8.74 12.89±6.55 Serum albumin(g/L) 25.02±5.04 35.88±6.57(2)29.0±4.37 34.0±6.58(2)Scr(μmol/L) 73.76±27.31 76.04±22.72 81.36±6.47 81.56±17.33 eGFR(m L·min-1·1.73 m-2) 90.35±29.84 92.872±34.15 82.03±13.47 85.78±17.6 Proteinura(g/24 h) 5.64±3.38 1.98±3.22(2)3.44±1.80 1.53±1.31(1)Nephrotic syndrome[n(%)] 36(76.60%) 8(16.0%)(2) 6(66.7%) 1(12.5%)(1)

免疫抑制剂或免疫抑制剂联合激素治疗可以有效地降低IMM患者的蛋白尿,改善患者的预后,但是并非对所有的患者均有效[13-15]。我们研究发现, IMN患者肾组织PLA2R阳性与否对判断激素或激素联合免疫抑制剂治疗IMN是否有效有一定的帮助。本研究显示,符合激素或激素联合免疫抑制剂治疗的IMN患者,无论肾组织PLA2R阳性或阴性,治疗前临床表现无显著差异,但肾组织PLA2R阳性IMN患者对激素或激素联合免疫抑制剂的治疗反应更好,尿蛋白缓解率显著高于肾组织PLA2R阴性患者。这可能是由于部分肾组织PLA2R阴性,诊断为IMN患者中仍有一部分为继发性膜性肾病患者,但由于就诊时及短期随访中未发现继发性膜性肾病的因素而诊断为IMN,如一些肿瘤相关的继发性膜性肾病患者在发现膜性肾病后数月甚至数年才确诊为肿瘤相关膜性肾病,这些患者对于激素或激素联合免疫抑制剂治疗的反应不佳。此外,一些IMN患者可能并非是PLA2R相关的[12,16-17],而是由其他抗原所致的IMN,此类患者是否对激素或激素联合免疫抑制剂治疗敏感也值得进一步研究。

总之,肾组织PLA2R染色方便快捷,是诊断IMN的良好指标,结合肾组织IgG4染色,可以更好地鉴别IMN和继发性膜性肾病;同时肾组织PLA2R染色阳性与否可以初步预测激素或激素联合免疫抑制剂治疗IMN的疗效,为有效选择治疗方案提供依据。本研究不足之处在于样本数量较少,随访时间相对较短,因此下一步研究仍需进一步扩大样本,延长随访时间,对本研究结果进行验证。

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Detection and the clinical significance of phospholipase A2receptor in idiopathic membranous nephropathy tissues

LIU Hong1,2,3,LUO Wei-li1,2,3,GONG Shao-min1,2,3,DING Xiao-qiang1,2,3△
(1Department of Nephrology,Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai,200032,China;
2Shanghai Institute of Nephrosis and Dialysis Shanghai 200032,China;3Shanghai Key
Laboratory of Kidney and Blood Purification,Shanghai 200032,China)

Objective To explore the positive rate and clinical significance of phospholipase A2receptor(PLA2R)in glomeruli of idiopathic membranous nephropathy(IMN)patients. Methods A retrospective study was taken.In the study group,101 patients who were both clinically and pathologically proved as IMN(All patients

neither glucocorticoid nor immunosupprants before having renal biopsy in our center)and followed up more than 1 year were included.In the controlgroup,13 patients who were clinically and pathologically proved as membranous nephropathy secondary to systemic lupus erythematosus(ClassⅤ),hepatitis virus B,Sjogren’s syndrome etc.and 20 patients whose pathological results were other than membranous nephropathy were included.PLA2R and the IgG subclasses in glomeruli were detected.The reduction of proteinuria and renal function were analyzed in both PLA2R positive and PLA2R negative IMN patients. Results Positive PLA2R glomerular deposits were found in 86.14%IMN patients while it was only 23.08%in patients with secondary membranous nephropathy(P＜0.001).PLA2R positive combined with IgG4 staining no less than moderate in the glomeruli was found in 83.75%patients in IMN group,which was found in none of the patients in secondary membranous nephropathy group(P＜0.01).In IMN group,in the at least 6 months’follow up after either glucocorticoid or glucocorticoid combined immunosupprants therapy,85.11%patients with glomerular PLA2R positive had remission in proteinuria while it was only 30.0%in patients with glomerular PLA2R negative(P＜0.01). Conclusions The positive rate of PLA2R in the glomeruli was more prevalent in IMN patients.PLA2R positive deposits combined with IgG4 staining no less than moderate was critical to discriminate between idiopathic and secondary membranous nephropathy.Glomeruli PLA2R deposits may be served as a nominator for therapeutic evaluation in IMN.

phospholipase A2receptor; idiopathic membranous nephropathy; secondary membranous nephropathy; proteinuria

R692.3

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.04.008

国家科技支撑计划(2011BAI10B00);上海市科委科研计划项目(14DZ2260200)△Corresponding author E-mail:ding.xiaoqing@zs-hospital.sh.cn

2014-12-22;编辑:段佳)