硬皮病伴发肺间质病变小鼠模型的建立及发病机制研究

张 立 李 正 曾海英 王 强

（1复旦大学附属中山医院皮肤科，2实验研究中心，3病理科 上海 200032）

硬皮病（systemic scleroderma，Ssc）是以局限性或弥漫性皮肤和内脏器官结缔组织的纤维化或硬化，最后发生萎缩为特点的疾病。是一种系统性或全身性自身免疫病，与系统性红斑狼疮和皮肌炎／多发性肌炎等都归类于自身免疫病范畴。近年来发现，硬皮病伴发肺间质病变（interstitial lung disease，ILD）发生率高达25%～90%[1］，且是Ssc致死的首要原因。然而，目前硬皮病伴发肺间质病变（Ssc－ILD）发病机制仍不清楚，值得深入研究。本课题组通过不断调整博来霉素（bleomycin，BLM）浓度来摸索建立Ssc－ILD小鼠模型的适宜条件，最终以C3H／He小鼠局部（背部皮肤）皮下注射0.4 mg／mL BLM成功建模，小鼠肺部可见典型的炎症和纤维化。我们通过HE和Masson染色明确模型的可靠性，并通过检测羟脯氨酸了解纤维化程度及免疫组化检测CD8＋T细胞、CD68＋巨噬细胞、TGF－β1、IL－23、collagen－1、MMP－9和α－SMA 来初步探讨Ssc－ILD的发病机制。

材料和方法

实验动物 8只SPF级C3H／He小鼠由上海复旦大学附属中山医院动物中心提供，雌性，6周龄，体质量（20±2）g，于清洁级动物实验室饲养。饲养1周后进行实验。每只小鼠背部中央区域去毛使皮肤裸露，便于注射和观察。随机等分为两组，分别为造模组和对照组。

BLM局部皮下注射建模 盐酸博来霉素粉剂（日本化学株式会社，规格15 mg／支）用PBS缓冲液（pH＝7.4）配制成浓度为3 mg／mL溶液，置于－20℃冰箱保存，临用前稀释成浓度为0.4 mg／mL的BLM。造模组在每天相同时间用0.4 mg／mL BLM背部皮肤皮下注射0.1 mL；对照组于相同部位皮下注射0.1 mL PBS，连续注射28天。

动物处理 观察实验过程中小鼠背部皮肤变化及被毛生长情况、活动度及健康状况。于第29天处死小鼠取标本。首先取皮，于注射部位处取1 cm×1 cm皮肤标本，一部分置于液氮中待测羟脯氨酸，另一部分浸于4%中性甲醛溶液中，待测病理和免疫组化；接着取肺，左叶存于液氮中，右叶浸于4%中性甲醛溶液中。

组织病理学观察 皮肤及肺组织标本予以4%中性甲醛溶液固定，脱水，石蜡包埋，切片（厚度3 μm），行常规HE染色及Masson染色。HE染色切片用Leica病理图像分析系统测定皮肤真皮厚度[2］，每张切片随机取5个部位检测真皮厚度（即表皮与皮下组织之间的真皮垂直距离），取均值进行统计，比较造模组与对照组的差异。Masson染色切片用Leica图片定量分析系统测定其组织化学染色图像[3］，每张切片随机取3处视野（×200），以蓝色为阳性，先选中视野范围内所有组织（除去空白部分）记录组织总面积，再选中蓝色部分记录胶原面积，计算胶原面积百分比（胶原面积百分比＝胶原面积／组织总面积）。

胶原含量分析 取大小约0.3 cm×0.3 cm的皮肤和肺组织，加生理盐水用匀浆器研磨成10%的匀浆。用羟脯氨酸试剂盒（南京建成生物工程研究所）进行检测，加设标准品管，与待测样品管一同水浴消化，先后加Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 液，2000×g离心10 min。取上清液在分光光度计550 nm处（1 cm光径）空白管调零后检测各标本吸光度。各管羟脯氨酸含量的计算公式：羟脯氨酸含量＝（测定D值－空白D值）／（标准D值－空白D值）×标准品浓度÷样本含量／所加匀浆介质。根据羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4%换算成胶原蛋白含量。

免疫组化染色 皮肤和肺组织经4%中性甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片，CD8＋、CD68＋、TGF－β1、IL－23、collagen－1、MMP－9、α－SMA 抗体（抗体工作浓度为1∶100，美国Abcam公司）孵育，用二步法EnVision（ChemMafeTMEnVision＋／HRP），DAB显色[二步法抗兔／鼠通用型免疫组化检测试剂盒，基因科技（上海）有限公司］，进行免疫组化染色。在组织细胞膜或细胞质中出现棕黄色颗粒的为阳性，在200倍光学显微镜下随机选取3个视野，用Image Pro－Plus 6.0分析软件定量分析。

统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件进行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

小鼠形态观察 造模组：背部皮肤注射部位出现皮肤显著增厚、硬化，弹性变差，注射点有破溃和结痂现象，毛发未恢复生长，小鼠体型变小；对照组：注射部位皮肤无明显变化，弹性较好，注射点无结痂，毛发恢复生长，小鼠体型无明显变化（图1）。

图1 小鼠大体形态变化Fig1 The general changes of mice

皮肤组织病理学观察 造模组小鼠相比对照组HE染色结果（图2A）显示真皮层显著增厚[图2D，（407.78±15.20）μmvs.（125.16±7.04）μm，P＜0.01］，胶原纤维束数量增多，形状增粗，排列紧密，向深部扩展至部分替代皮下脂肪组织；在真皮深部看到典型的血管壁增厚纤维化（图2C）。对照组小鼠皮肤组织无明显病理改变。

皮肤纤维化程度 造模组和对照组小鼠皮肤胶原面积百分比分别为75.23%±0.98%和13.84%±3.87%（图2B），皮肤胶原含量分别为（450.00±37.64）μg／g和（193.12±13.21）μg／g，造模组均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01，图2E、图3）。同时发现，胶原以Ⅰ型胶原为主，并且造模组与对照组相比含量显著增多（图4A，63.45±5.90 vs.6.39±0.78，P＜0.01）。

图2 小鼠皮肤组织学变化Fig2 Histological changes in the skins of mice

A：HE staining（×200）；B：Masson′s staining（×200）；C：Thickened wall of small blood vessel in dermis（×200）；D：Skin thickness；E：Collanen area rate.vs.Control group，（1）P＜0.01.

图3 小鼠皮肤和肺胶原含量比较Fig3 Comparison of content of collagen in skin and lung of mice

图4 小鼠皮肤和肺的Ⅰ型胶原含量比较Fig4 Comparison of collagenⅠin skin and lung fo mice

组织病理学观察 造模组小鼠肺组织中可见肺泡间隔增宽伴有炎性细胞渗出及浸润，肺泡结构破坏；对照组小鼠肺泡结构正常（图5A）。

肺部炎症程度 造模组和对照组小鼠肺部组织炎性细胞渗出主要为CD8＋T细胞（图6A，40.37±1.07 vs.10.36±0.66，）和CD68＋巨噬细胞（图6B，32.06±0.43 vs.5.83±0.31），造模组均显著高于对照组；造模组细胞因子IL－23也显著高于对照组（图6C，30.36±1.52 vs.6.87±0.41，P＜0.01）。

图5 小鼠肺部组织学变化Fig5 Histological changes in the lungs of mice

图6 小鼠肺部组织炎症变化Fig6 Changes of inflammation in the lungs of mice

纤维化程度 造模组和对照组小鼠肺组织胶原面积百分比分别为47.38%±5.01%和7.93%±3.97%（P＜0.01），两组肺组织胶原含量分别为（314.93±23.96）μg／g和（142.62±9.36）μg／g，造模组均高于对照组，差异均有统计学意义（图5C，P＜0.01）。造模组的Ⅰ型胶原表达显著增高（图4B，22.79±1.60 vs.12.58±0.51，P＜0.01）；TGF－β1表达显著增多（图7A，28.58±2.29 vs.5.17±0.74，P＜0.01）；MMP－9表达显著增多（图 7B，53.59±3.50 vs.5.27±1.8，P＜0.01）；标记肌成纤维细胞的α－SMA表达显著增高（图7C，50.64±1.19 vs.4.99±1.07，P＜0.01）。

图7 小鼠肺组织纤维化指标变化Fig7 Changes of fibrosis in the lungs of mice

讨 论

ILD是增加Ssc等结缔组织病住院率和死亡率的首要原因，因此通过建立Ssc－ILD动物模型来探究其发病机制并寻找新的靶点，可为防治该组疾病提供新的思路。自Yamamoto等[4］成功诱导小鼠皮肤硬化以来，国内外众多学者尝试建立Ssc动物模型。文献报道，C3H／He等小鼠是对BLM十分敏感的动物品系[5］。BLM是一种广泛运用于肿瘤治疗的化疗药物，其不良反应包括肺纤维化或硬皮病样改变[6］。本研究前期发现，给予浓度0.1 mg／mL BLM连续皮下注射28天，小鼠皮肤出现轻度增厚，但肺部并没有炎性改变（图8A）；而当调整浓度至0.2 mg／mL时，小鼠皮肤增厚明显，而肺泡壁轻度增宽但不明显（图8B）；最终当浓度调整至0.4 mg／mL时，出现典型的皮肤硬化和肺部组织ILD改变，提示BLM的致肺部纤维化作用是呈浓度依赖性的，对临床化疗中用BLM的浓度有一定的提示意义。

本课题组在国内首次成功建立Ssc－ILD动物模型：以浓度为0.4 mg／mL BLM对C3H／He小鼠进行连续28天局部皮下注射，成功建立Ssc－ILD模型；小鼠不仅皮肤产生与Ssc相似的组织病理学改变，并且肺部组织也出现显著炎症和纤维化。在此基础上，本课题组初步探讨Ssc－ILD的发病机制。

炎症和纤维化是Ssc的特征性改变，由炎性细胞和细胞因子共同作用，导致成纤维细胞的活化和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积[7］。其中，转化生长因子－β（TGF－β）参与纤维化的全过程，在Ssc发病机制中起关键作用[8］；尤其是TGF－β1，能促进成纤维细胞增殖分化为表达α－SMA的肌成纤维细胞，并分泌大量的ECM，启动纤维化过程[9－10］。Yamamoto 等[11］研究发现抗TGF－β治疗后，α－SMA表达显著减少，进一步肯定了TGF－β对成纤维细胞的刺激作用。有学者发现TGF－β致肺纤维化是通过下调成纤维细胞和单核细胞中的小凹蛋白－1（caveolin－1）；因为Ssc患者成纤维细胞和单核细胞释放TGF－β增多使caveolin－1表达减少，从而抑制Smad3磷酸化同时增加TGF－β配体的内吞和降解，最终导致纤维化[12－13］。本研究结果表明，皮肤真皮显著增厚，胶原纤维堆积，小血管壁增厚纤维化；其中，TGF－β－1、collagen1、α－SMA 在造模组中显著增多，提示TGF－β1参与Ssc皮肤硬化过程，且可能是通过α－SMA导致真皮层collagen－1增多。

图8 0.1和0.2mg／mL BLM注射小鼠皮肤和肺变化（×200）Fig8 Changes of skin and lung after injection of BLM at concentration of 0.1and 0.2mg／mL（×200）

在Ssc－ILD中，成纤维细胞是肺纤维化启动和维持的主要细胞类型，并通过TGF－β介导，释放大量Ⅰ型胶原蛋白[14］。TGF－β1是炎症进展为纤维化的重要中间介质[15］。Ssc－ILD引起肺部炎症微环境发生变化，TGF－β、单核细胞趋化因子－1、巨噬细胞炎性蛋白等上调，导致淋巴细胞聚集和胶原纤维的沉积[16］。炎性细胞如T细胞、巨噬细胞等参与Ssc的发病进程，产生大量细胞因子导致ECM增多和血管损伤[17］。进一步研究明确是CD8＋T淋巴细胞[18］和 CD68＋巨噬细胞[19］参与发病过程。最新的基因芯片技术表明巨噬细胞的聚集活化和TGF－β基因上调与Ssc－ILD中肺纤维化进展密切相关[20］。目前认为TGF－β主要通过Samd和非Smad通路引起纤维化的发生，而近期亦有研究表明其作用同时与 Toll样受体4（TLR－4）有关。TLR－4能识别脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），增加成纤维细胞对 TGF－β1的敏感性，引起由 TGF－β1介导的前Ⅰ型胶原α1链（COL1A1）mRNA和Ⅰ型胶原蛋白表达增多。在TLR－4基因敲除鼠中，α－SMA表达显著减少。TLR－4对正常成纤维细胞的刺激作用参与ECM重建和组织修复，协同增加TGF－β1调节的纤维化进程[21］。

MMP－9是近年来发现与肺纤维化相关的金属基质蛋白酶。纤维化早期病变的发生是由炎性反应（iNOS和 COX－2）、凋亡（p53和caspase－3）以及基质损伤（MMP－9、MMP－2和 COL1A1）引起[22］。在肺纤维化中，Thy－1阴性的成纤维细胞内 MMP和TGF－β1增多[23］。生长因子如 TGF－β在基因 水 平调控 MMP[24］。MMP－9在 BLM 引起的肺纤维化的支气管肺泡灌洗液中增高，而用 MMP抑制剂batimastat后能改善肺纤维化[25］，提示 MMP－9参与肺纤维化进程。在硬皮病肺动脉高压中，MMP－9和血管内皮生长因子含量显著增多，其中 MMP－9通过胶原重建而刺激血管生成同时也控制血管过度形成[26］。

IL－23参与硬斑病（局限性硬皮病）发病。IL－17是许多炎症和自身免疫疾病的重要炎性因子，而IL－23是刺激IL－17合成的主要细胞因子[27］。

本实验结果表明，在模型组小鼠肺组织中，TGF－β1显著增多伴随着与纤维化密切相关的α－SMA、collagen－1、MMP－9 升高，而与炎症相关的CD8＋T细胞、CD68＋巨噬细胞以及炎性因子IL－23显著增多，上述观察性的现象和最新相关文献报道提示Ssc－ILD的发生极可能是通过上调TGF－β1，导致肌成纤维细胞活化和增生，由巨噬细胞提呈和CD8＋T细胞协助，产生IL－23和TGF－β1，从而引起MMP－9增多，最终致ECM 增多，形成肺纤维化。目前，我们在动物模型上发现的现象仅初步探索了可能参与Ssc－ILD的因素，对于其发病机制还需结合体内体外试验作进一步深入研究。

[1]Winstone TA，Assayag D，Wilcox PG，et al.Predictors of mortality and progression in scleroderma－associated interstitial lung disease：a systematic review[J］.Chest，2014，146（2）：422－436.

[2]Kajii M，Suzuki C，Kashihara J，et al.Prevention of excessive collagen accumulation by human intravenous immunoglobulin treatment in a murine model of bleomycin－induced scleroderma[J］.Clin Exp Immunol，2011，163（2）：235－241.

[3]Zhang L，Fu XH，Yu Y，et al.Treatment with CA－074 Me，a Cathepsin B inhibitor，reduces lung interstitial inflammation and fibrosis in a rat model of polymyositis[J］.Lab Invest，2015，95（1）：65－77.

[4]Yamamoto T，Takagawa S，Katayama I，et al.Animal Model of Sclerotic Skin.I：Local Injections of Bleomycin Induce Sclerotic Skin Mimicking Scleroderma[J］.J Invest Dermatol，1999，112（4）：456－462.

[5]Oi M，Yamamoto T，Nishioka K.Increased expression of TGF－beta1 in the sclerotic skin in bleomycin－′susceptible′mouse strains[J］.J Med Dent Sci，2004，51（1）：7－17.

[6]Burger RM.Cleavage of Nucleic Acids by Bleomycin[J］.Chem Rev，1998，98（3）：1153－1170.

[7]Bhattacharyya S，Wei J，Varga J.Understanding fibrosis in systemic sclerosis：shifting paradigms，emerging opportunities[J］.Nat Rev Rheumatol，2012，8（1）：42－54.

[8]Varga J，Pasche B.Transforming growth factor beta as a therapeutic target in systemic sclerosis[J］.Nat Rev Rheumatol，2009，5（4）：200－206.

[9]Ihn H.Scleroderma，fibroblasts，signaling，and excessive extracellular matrix[J］.Curr Rheumatol Rep，2005，7（2）：156－162.

[10]Hinz B，Phan SH， Thannickal VJ，et al. The myofibroblast：one function，multiple origins[J］.Am J Pathol，2007，170（6）：1807－1816.

[11]Yamamoto T，Nishioka K.Animal model of sclerotic skin.V：Increased expression of alpha－smooth muscle actin in fibroblastic cells in bleomycin－induced scleroderma[J］.Clin Immunol，2002，102（1）：77－83.

[12]Trojanowska M.Noncanonical transforming growth factor beta signaling in scleroderma fibrosis[J］.Curr Opin Rheumatol，2009，21（6）：623－629.

[13]Del GF，Sotgia F，de Almeida CJ，et al.Decreased expression of caveolin 1 in patients with systemic sclerosis：crucial role in the pathogenesis of tissue fibrosis[J］.Arthritis Rheum，2008，58（9）：2854－2865.

[14]Ihn H.Autocrine TGF－beta signaling in the pathogenesis of systemic sclerosisJ.J Dermatol Sci2008492103－113.

[15]Bonniaud P，Margetts PJ，Ask K，et al.TGF－beta and Smad3 signaling link inflammation to chronic fibrogenesis[J］.J Immunol，2005，175（8）：5390－5395.

[16]Luzina I G，Kopach P，Lockatell V，et al.Interleukin－33 potentiates bleomycin－induced lung injury[J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2013，49（6）：999－1008.

[17]Yamamoto T，Takagawa S，Katayama I，et al.Effect of superoxide dismutase on bleomycin－induced dermal sclerosis：implications for the treatment of systemic sclerosis[J］.J Invest Dermatol，1999，113（5）：843－847.

[18]Nuovo GJ，Hagood JS，Magro CM，et al.The distribution of immunomodulatory cells in the lungs of patients with idiopathic pulmonary fibrosis[J］.Mod Pathol，2012，25（3）：416－433.

[19]Yamashita M，Iwama N，Date F，et al.Macrophages participate in lymphangiogenesis in idiopathic diffuse alveolar damage through CCL19－CCR7 signal[J］.Hum Pathol，2009，40（11）：1553－1563.

[20]Christmann RB，Sampaio－Barros P，Stifano G，et al.Association of Interferon－and transforming growth factor beta－regulated genes and macrophage activation with systemic sclerosis－related progressive lung fibrosis[J］.Arthritis Rheumatol，2014，66（3）：714－725.

[21]Bhattacharyya S，Kelley K，Melichian DS，et al.Toll－like receptor 4 signaling augments transforming growth factorbeta responses：a novel mechanism for maintaining and amplifying fibrosis in scleroderma[J］.Am J Pathol，2013，182（1）：192－205.

[22]Park EJ，Roh J，Kim SN，et al.A single intratracheal instillation of single－walled carbon nanotubes induced early lung fibrosis and subchronic tissue damage in mice[J］.Arch Toxicol，2011，85（9）：1121－1131.

[23]Sueblinvong V， Neujahr DC， Mills ST，et al.Predisposition for disrepair in the aged lung[J］.Am J Med Sci，2012，344（1）：41－51.

[24]Papakonstantinou E，Aletras AJ，Roth M，et al.Hypoxia modulates the effects of transforming growth factor－beta isoforms on matrix－formation by primary human lung fibroblasts[J］.Cytokine，2003，24（1－2）：25－35.

[25]Corbel M，Caulet－Maugendre S，Germain N，et al.Inhibition of bleomycin－induced pulmonary fibrosis in mice by the matrix metalloproteinase inhibitor batimastat[J］.J Pathol，2001，193（4）：538－545.

[26]Grigoryev DN，Mathai SC，Fisher MR，et al.Identification of candidate genes in scleroderma－related pulmonary arterial hypertension[J］.Transl Res，2008，151（4）：197－207.

[27]Danczak－Pazdrowska A，Kowalczyk M，Szramka －Pawlak B，et al.Interleukin－17A and interleukin－23 in morphea[J］.Arch Med Sci，2012，8（6）：1089－1095.