酪氨酸激酶抑制剂对肾癌免疫微环境的调节及其机制

赵 奇（综述） 胡骁轶 郭剑明 王国民（审校）

（复旦大学附属中山医院泌尿外科 上海 200032）

肾细胞癌是泌尿系统的常见恶性肿瘤，占所有成人恶性肿瘤的2%～3%。在初诊肾癌的患者中，20%～30%已存在转移，另有将近30%的局限性肾癌患者在后续的治疗中发生转移［1］。而转移性肾癌（metastatic renal cell carcinoma，mRCC）的5年生存率仅10%［2］。近年来，以血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，VEGFRTKI）为代表的分子靶向药物治疗，正逐步替代传统的干扰素、白介素治疗，成为目前mRCC的标准治疗方案。

具有酪氨酸激酶活性的靶受体有许多种，包括血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growthfactor receptor，VEGFR）－1、2、3，血小板衍生生长因子受体（platelet－derived growth factor receptor，PDGFR）－α和β，干细胞因子受体（stemcell factor receptor，c－KIT）、1型集落刺激因子受体（colony－stimulating factor－1 receptor，CSF－1R）和Fms样酪氨酸激酶3（Fms－like tyrosine kinase receptor 3，FLT－3）等。索拉非尼、舒尼替尼等药物是多靶点酪氨酸激酶的抑制剂，虽然TKI的应用为mRCC患者提供了新的治疗途径，但单用舒尼替尼等药物的最初反应率也仅为30%～40%，并且在6～15个月后发生疾病进展［3］。值得注意的是，一些实验现象不能完全解释TKI抑制肿瘤血管而达到治疗效果，例如，患者血清中VEGF水平与药物的反应率并不相关［4－5］。服药后肿瘤细胞凋亡发生在肿瘤滋养血管抑制之前，这与药物使肿瘤血管减少而抑制肿瘤的解释在时间顺序上相矛盾［6］。这些都表明TKI除了抑制肿瘤血管形成外，可能存在其他的机制。因此，肾癌的免疫治疗作为曾经的标准治疗又重新进入我们的视野。TKI联合干扰素治疗虽不良反应较大，但疗效优于单药治疗［7］。高剂量IL－2在有选择的肾癌患者治疗中仍有作用，并且肾癌程序性死亡（PD－1／PD－L1）通路的免疫治疗研究进展迅速，可能迎来一个新的免疫治疗时代。所以，阐明TKI与肾癌免疫之间的机制，可以为TKI联合用药和针对性用药提供依据。

患者免疫微环境在肾癌治疗中的地位 机体抗肿瘤的主要方式是细胞免疫。具有免疫原性的肾癌细胞，可以引起机体特异性免疫应答，其主要通过CD8＋细胞毒性T淋巴细胞（CD8＋CTL）介导的穿孔素／颗粒酶或Fas／FasL途径或由T细胞产生的细胞因子使肿瘤靶细胞崩解［8］。但是肾癌进行性生长说明肿瘤细胞可以逃避机体的免疫攻击。

机体免疫功能抑制是导致肿瘤发展及治疗失败的重要原因，肿瘤细胞可以产生多种免疫抑制性物质，促进肿瘤细胞增殖。近年来，肾癌中PD－1／PDL1通路的抑制取得了突破性疗效，同时也证明了肾癌进展过程中免疫抑制的作用。肾癌细胞、肿瘤浸润淋巴细胞及抗原提呈细胞细胞膜上表达PD－L1，其与效应T细胞上的PD－1结合，传递负性调控信号，导致肿瘤抗原特异性T细胞的凋亡或免疫无能，形成免疫抑制的肿瘤微环境，进而促使肿瘤细胞的逃逸［9］。

肾癌的肿瘤微环境涉及到CD4＋Foxp3＋调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）及多种细胞因子、抗原簇，此类分子形成的免疫检查点阻断是肾癌免疫治疗的热点领域［10］。包括肾癌在内的多种实体肿瘤，都测得Treg的活性增强。Treg通过细胞接触方式发挥抑制CD8＋细胞的作用，并在转录水平抑制穿孔素、颗粒酶及γ干扰素的分泌，使CD8＋T细胞出现对外界刺激的低反应性［11］。除了IL－2通过激活细胞因子介导杀伤细胞（cytokine－induced killercells，CIK）对部分肾癌具有明确的治疗作用外，IL－6、IL－8等细胞因子还参与了血管诱导生成，调节树突状细胞、T细胞成熟，具有趋化作用［12］。

TKI对肾癌免疫微环境的调节作用

骨髓源性抑制细胞（myeloid－derived suppressor cell，MDSC） MDSC是骨髓来源的具有免疫抑制功能的异质性细胞，根据形态及功能分为不同细胞亚群，主要包括单核样、粒细胞样及少量的树突状细胞和髓系前体细胞，是免疫系统的重要负性调节组分之一［13］。肿瘤微环境中的多种细胞因子或生长因子可通过激活相应的信号通路促进MDSC扩增及活化，进而通过包括抑制TCR通路、抑制T细胞生物学活性、诱导Treg细胞扩增在内的多种机制抑制免疫细胞的功能，促进肿瘤个体免疫耐受的发生。

Kusmartsev等［14］从肾癌患者外周血中分离所得的MDSC在体外通过活性氧（reactive oxygen species，ROS）和一氧化氮（NO）作用于细胞毒性T淋巴细胞来影响抗原特异性T细胞反应，运用拮抗NO药物可以明显减弱MDSC介导的T细胞抑制反应。

舒尼替尼对于MDSCs扩增和激活具有抑制作用。Ko等［15］发现，转移性肾癌患者CD33＋HLA－DR－MDSC和CD15＋CD14－MDSC水平较正常人群高；同一患者在舒尼替尼治疗后MDSC计数有所下降，并且具有肿瘤杀伤作用的1型T细胞数目上升。此实验证实了MDSC的数目上升可能加大患者肿瘤转移的概率，并且舒尼替尼有助于减少MDSCs，增加T细胞对肿瘤的杀伤作用。进一步的体外试验发现，随着 MDSC耗尽，INF－γ迅速恢复正常水平，T细胞可以随INF－γ扩增，猜测 MDSC可能通过抑制INF－γ从而调节T细胞使肿瘤获得免疫逃逸。在体外用药，舒尼替尼仍有抑制MDSC作用，但不影响 MDSCs成熟［16］。

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM－CSF） GM－CSF是一种调节造血细胞增殖和分化的细胞因子，相对分子质量为22 000，可以用于治疗晚期化疗所引起的粒细胞缺乏症。有研究显示GM－CSF在宫颈癌、乳腺癌等肿瘤人群血浆中呈高表达［16］。

Yamada等［17］通过对单中心13例晚期肾癌患者服用 TKI前血清中包括 GM－CSF、IL－1ra、IL－2、MIP－1α、PDGF－BB 等在内的 27 种细胞因子的对比，发现在治疗后获得PR患者中GM－CSF的水平远高于SD或PD患者。因此，他们认为GM－CSF可以作为TKI治疗能否获益的预测指标，并猜测TKI的疗效可能与GM－CSF有关。

TKI抑制GM－CSF的促肿瘤机制虽未在肾癌中有明确研究，但在乳腺癌的肿瘤模型中证实TKI阻断了 GM－CSF促 MDSC作用［18］。Nagaraj等［19］把 MDSC按CD11b＋／Gr－1＋表达量分成高、中、低3个亚群，CD11b＋／Gr－1＋表达量与免疫抑制作用呈反相关。通过基因沉默的方法敲除小鼠GM－CSF，发现 MDSC亚群的比例发生变化，Gr－1＋中低表达的MDSC的细胞计数减少。GM－CSF可以优先促使Gr－1＋中低表达的 MDSCs分化与扩增，从而减少CD8＋T细胞的细胞毒性，介导肿瘤的免疫耐受。因此，肾癌患者高GM－CSF可以通过TKI来抑制其促MDSC作用，可能是TKIs的获益机制。

信号转导子及转录激活因子 信号转导子及转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT3）STAT是常见的肿瘤信号通路JAK／STAT的重要组成部分，参与肿瘤的发生、发展。STAT3是STAT家族一员，在细胞内起着重要的信号传递作用，负责将细胞外的信号传递至细胞核，通过诱导 Bcl－2、Bcl－xl、Mcl－1、Survivin等抗凋亡基因转录表达，发挥细胞增殖、分化的效应作用［20］。激活STAT3可以抑制肿瘤表达促炎因子与抑制树突细胞成熟［21］。阻断STAT3可以增加肿瘤组织表达细胞因子及趋化因子，激活先天免疫，活化树突细胞，进而导致肿瘤特异性的T细胞应答［22］。

Kortylewski等［23］通过敲除小鼠 Stat3－／－，发现其树突细胞、T细胞、NK细胞、粒细胞功能都有大幅提高。运用小分子靶向药物抑制STAT获得了同样的激活免疫细胞的效果。同时发现STAT的持续活化不仅存在于肿瘤组织，而且在内皮细胞、肿瘤相关巨噬细胞等髓样细胞中广泛存在，是肿瘤扩增转移的重要因素。

Xin等［24］体外肿瘤细胞实验证实了虽然舒尼替尼不改变STAT3总浓度，但可以抑制磷酸化STAT3（phosphorylated STAT3，p－STAT3），而p－STAT3与肿瘤的凋亡密切相关。舒尼替尼同时还抑制Src，Src是STAT3上游的磷酸化激酶，在多种肿瘤中过表达。免疫组化电镜显示，在舒尼替尼的作用下核内STAT3转移到胞浆，阻断Src介导的STAT3活化。而在小鼠体内实验则证实，舒尼替尼抑制肿瘤的生长与STAT3呈负相关。

Yuan等［25］则用阿西替尼获得了与舒尼替尼相似的结果。阿西替尼在Balb／c小鼠RENCA肾癌模型中对于肿瘤细胞STAT3总蛋白浓度没有影响，而 明显抑制的 p－STAT3，对其下游 Bcl－xL、Survivin、CyclinD1进行 Western blot分析，与p－STAT3成比例下降。免疫组化亦验证了阿西替尼在RCC组织中的抑制p－STAT3作用。

近年来的研究发现，STAT3也参与了 MDSC的信号调节。STAT在免疫细胞中的激活可以募集肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和 MDSC［26］。分离出MDSCs的肿瘤小鼠中STAT呈高表达。在肺腺癌的小鼠模型中也得出了类似结论，肺上皮细胞高表达STAT后，MDSC在肺泡中明显扩增，其表达的细胞因子IL－1β、IL－6、IL－10、IL－13、INF－γ、TNF－α、GM－CSF浓度上升，肿瘤明显生长与转移［27］。STAT下游的干扰素调节因子8（IRF8）参与了STAT与 MDSC之间的调节［28］。另外，IFN－α参与抗肿瘤免疫的细胞激活，其信号传导则涉及到JAK／STAT通路［29］，因此，MDSC可以干扰IFN－α介导的宿主免疫，并且证实MDSC产生NO从而参与免疫细胞对IFN－α的耐受［30］。

STAT3与p－STAT3的抑制ROS、精氨酸酶－1（arginase－1，Arg－1）活性的下降相一致，并通过流式细胞术显示 MDSC计数下降［26］。ROS 、Arg－1与MDSC的功能密切相关，ATP／P2X7轴参与了肿瘤微环境中 MDSC的作用［31］。

T细胞反应与Treg T细胞介导的细胞免疫是免疫系统消灭肿瘤最重要的“武器”之一。肾癌患者的T细胞免疫2型反应（IL－4）比1型反应（IFN－γ）占优势，患者细胞内液IL－4比IFN－γ水平高。舒尼替尼治疗后，1型T细胞因子反应有所增强，可能是由于舒尼替尼对Treg的抑制所致［32］，并且运用分离得到的Treg输注经舒尼替尼治疗后的T细胞后发现其免疫抑制作用减弱［33］。Treg数目的增加与肾癌分期和分级呈正相关［34］。运用流式细胞术可以直接观测服用舒尼替尼、索拉非尼或阿西替尼后各类T细胞的改变，Treg抑制后可以促进效应T细胞对肿瘤的杀伤作用［16，26，35］。但也有文献指出索拉非尼具有诱导外周血Treg的作用而舒尼替尼未发现此现象［36］，可能由于索拉非尼相较于舒尼替尼有抑制Raf1激酶作用，其与Treg分化有关［37］。

结语 虽然肾癌靶向治疗作为mRCC的一线用药取得了较好的临床效果，但抗肿瘤的低反应率和耐药等问题仍亟需解决。肿瘤的微环境免疫变化是近年来提出的热点，由于局部免疫微环境与肿瘤发生发展息息相关，对其机制的深入研究意义重大。多靶点TKIs作为抑制血管形成的抗肿瘤药物，其对肿瘤及机体的免疫调节作用也不容忽视。

靶向药物联合免疫治疗，可能成为肾癌治疗的新趋势。我们前期研究发现肾癌的预后与环氧化酶－2（cyclooxygenase－2，COX－2）表达相关联，抑制COX－2对 Treg有下调作用［38－39］。并在 balb／c小鼠Renca模型中进行COX－2抑制剂联合IL－2治疗，发现联合用药疗效优于单独用药［40］。我们推测TKI联合COX－2也有望加强疗效，并减少TKI用量及不良反应。此外，Nivolumab（anti－PD－1；BMS－936558；ONO－4538）等PD－1／PD－L1通路的抑制剂已在临床试验中取得令人欣喜的疗效，其机制亦与MDSC、Treg有关，联合TKI有理论依据。2013年美国临床肿瘤学会（ASCO）年会上已有专家提出TKI与PD－1／PD－L1抑制剂联用的建议。

机体免疫调节十分复杂，涉及多种信号通路与细胞间信号传递。深入研究TKI调节肾癌免疫微环境的关系可以为治疗提供一个新思路。

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