土壤中产广谱抗菌肽菌株的筛选及鉴定

唐峰，李哲，王铁良，唐雨顺，刘永华，寇叙，刘秀萍⋆

（1.辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁锦州121001；2.天津市津南区畜牧水产发展服务中心，天津300350）

土壤中产广谱抗菌肽菌株的筛选及鉴定

唐峰1，李哲2，王铁良1，唐雨顺1，刘永华1，寇叙1，刘秀萍1⋆

（1.辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁锦州121001；2.天津市津南区畜牧水产发展服务中心，天津300350）

用双层平板法从土壤中分离到4株具有广谱抑菌活性的菌株，利用琼脂扩散法测定其对鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌、福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌的抑菌能力，筛选其中抑菌能力最强的菌株命名为JZ4。菌液上清分别经过盐析、透析或与蛋白酶作用后测定其抑菌能力，发现该抑菌物质中含有肽类物质。经16S rDNA序列比对，初步鉴定其为侧孢短芽孢杆菌。

土壤；抗菌肽；抑菌；侧孢短芽孢杆菌

抗菌肽也称抗微生物肽，是生物体固有免疫系统的重要组成部分。抗菌肽不仅具有抗细菌的活性，而且具有抗真菌、抗寄生虫、肿瘤的活性[1]。使用抗菌肽作为饲料添加剂代替抗生素已成为饲料学科的研究热点。与动物抗菌肽和植物抗菌肽相比，细菌抗菌肽提取容易、生产周期短。但是，目前开发利用的细菌抗菌肽为数较少。本试验通过筛选所获得的抗菌肽具有广谱抗菌能力，对常见病原菌具有较好的抑菌效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品采自锦州市8个饲料厂的土壤，共24份。

1.1.2 指示菌鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌、福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉（本实验室保存）。

1.1.3 培养基营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂，购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.1.4 引物27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492-r：TACGGCTACCTTGTTACGACTT。

1.2 方法

1.2.1 产抑菌物质菌株的分离、纯化采用双层平板法[2]。将土壤做梯度稀释，取0.5 mL悬浊液加入到已接种金黄色葡萄球菌的营养琼脂培养基中，再加入45℃营养琼脂培养基，混匀。25℃培养。挑取产生抑菌圈的菌落，进行纯化。

1.2.2 产抑菌物质菌株的筛选分别以鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌、福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉为指示菌，用生理盐水稀释至OD600=0.2，与营养琼脂培养基混匀制成指示平板。将产抑菌物质菌株接种至营养肉汤培养基，25℃200 r/min培养24 h，8 000 r/min离心10 min，取上清。采用琼脂打孔扩散法测定上清的抑菌效果。

1.2.3 抑菌物质的初步鉴定对抑菌能力较强菌株产生的抑菌物质成分进行鉴定。①有机酸碱作用的排除：比较培养24 h后的营养肉汤培养基与接种前的营养肉汤培养基的pH，判断是否产生有机酸碱。②盐析后抑菌活性测定：用65%的硫酸铵对4 mL菌液上清进行盐析，用磷酸盐缓冲液溶解沉淀后，进行抑菌活性测定。③透析后抑菌活性测定：用透析袋（8～14 kD）对4 mL菌液上清进行透析，用PEG 20000浓缩，浓缩液用磷酸盐缓冲液调整至4 mL，进行抑菌活性测定。④蛋白酶处理后菌活性测定：将0.4 mL菌液上清加到终浓度为l mg/mL的蛋白酶K或胃蛋白酶中，调整蛋白酶K的pH=7.0，胃蛋白酶pH=2～3，37℃水浴4 h，进行抑菌活性测定。

1.2.416 S rDNA序列分析利用通用引物27f、1492r扩增纯化后的菌液，将PCR产物测序。测序结果在GenBank中比对。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选24份土壤中，得到4株具有明显抑菌能力的菌株，分别命名为JZ1、JZ2、JZ3、JZ4。其中JZ4的抑菌能力最强。抗菌谱见表1。

表1 不同菌株的抑菌环直径Table1 Differences in the bacteriostatic ring diametermm

2.2 抑菌物质的初步鉴定JZ4培养24 h后的菌液上清pH=7.5，与培养基自身的pH未见明显区别。所以，JZ4的抑菌能力不是由有机酸或碱产生的。菌液经盐析、透析以及蛋白酶处理后抑菌环直径如表2所示。其中，经盐析后的蛋白粗提液抑菌圈大于盐析前菌液的抑菌圈。菌液经透析后，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈未见明显变化。菌液对胃蛋白酶有一定敏感性，抑菌能力有所下降。综合以上结果，可以初步判断该菌液的抑菌物质含有肽类物质或蛋白质。

表2 JZ4菌株经不同处理后对金黄色葡萄球菌的抑菌环直径Table2 Bacteriostatic ring diameter after different treatment of JZ4

2.3 测序结果菌株JZ4的16S rDNA序列与Brevibacillus laterosporus strain BL-1同源性为99%。利用DNAMan软件构建系统进化树，如图1所示。菌株JZ4在亲缘关系上与侧孢短芽孢杆菌属非常相近，初步鉴定为侧孢短芽孢杆菌。

3 讨论

图1 菌株JZ4系统进化树Fig.1 Phyletic evolution tree of JZ4

抗菌肽的来源可以分为4大类，即昆虫、动物、微生物及人工合成。已有报道的抗菌肽总量多达1 500种[3]，其中，从土壤微生物中分离得到的抗菌肽报道较少。土壤中微生物种类复杂，来源丰富，因此土壤是筛选分泌抗菌肽菌株的理想来源。研究表明，饲粮中添加抗菌肽能抑制病菌繁殖，通过改善动物肠道菌群结构[4]，促进动物健康[5]并提高生产性能[6]。与目前饲料中广泛使用的兽药相比，抗菌肽不会在动物性食品中残留，不易产生细菌耐药性[7]。因此，抗菌肽有望替代兽药，成为新型饲料添加剂，并已展现出诱人的前景[8-9]。由于抗菌肽生产成本较高，因此限制了抗菌肽在生产中的应用。利用基因工程菌异源表达抗菌肽是一种新模式。利用大肠杆菌表达系统[10]、毕赤酵母表达系统[11]表达抗菌肽的报道陆续出现。本研究组计划在获得分泌抗菌肽菌株的基础上，纯化抗菌肽并进一步研究其抗菌活性和理化性质，并利用基因工程菌异源表达该抗菌肽。

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（编辑：张婷婷）

Identification and Screening of Broad-spectrum Antibiotics-producing Strains from Soil

Tang Feng1,Li Zhe2,Wang Tieliang1,Tang Yushun1, Liu Yonghua1,Kou Xu1,Liu Xiuping1*

(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Liaoning Medical University,LiaoningJinzhou 121001; 2.Jinnan Develop and Service Center of Animal Husbandry and Aquaculture,Tianjin300350)

In this study,4 strains with broad-spectrum antibacterial activitywere isolated from soil with double-plate method,and the inhibition activity against Salmonella typhimurium,E. coli,Shigella,Staphylococcus aureus,and Aspergillus niger were determined by agar diffusion method.1 strain named JZ4 with greater inhibition zone was identified.Salting-out,dialysis and protease experiment were carried out and then preliminary determined that the antibiotics were antibacterial peptide.According to the sequence of 16S rDNA,strain JZ4 were identified as Brevibacillus laterosporus.

Soil;Antibacterial peptide;Inhibition activityl;Brevibacillus laterosporus

S852.6文献标识码：B文章编号：1672-9692(2015)02-0011-04

2014-11-14

唐峰（1980-），男，博士，副教授，主要从事动物防疫检疫方向的研究。

刘秀萍（1963-），女，本科，副教授，主要从事动物性食品检疫检验方向的研究。

辽宁医学院横向课题（LYHX2012076）、辽宁省教育厅科学研究一般项目（L2012306）、辽宁省科技厅自然科学基金（联合基金）项目（2013022041）