大孔树脂法分离纯化锁阳总黄酮

张喜峰，罗光宏，王春晖*

（1.河西学院农业与生物技术学院，甘肃张掖734000；2.河西学院凯源生物技术开发中心，甘肃省微藻工程技术研究中心，甘肃张掖734000）

大孔树脂法分离纯化锁阳总黄酮

张喜峰1，罗光宏2，王春晖1*

（1.河西学院农业与生物技术学院，甘肃张掖734000；2.河西学院凯源生物技术开发中心，甘肃省微藻工程技术研究中心，甘肃张掖734000）

为了分离、纯化锁阳总黄酮，比较了5种大孔树脂的静态吸附过程，筛选出了适合分离锁阳总黄酮的树脂。结果表明，AB-8树脂对锁阳总黄酮有较好的分离纯化效果，其吸附过程可用Langmuir和Freundlich吸附等温式来描述；吸附条件：溶液质量浓度3.9 mg/mL，pH值为5，吸附体积5 BV，流速2 BV/h，温度25℃；洗脱条件：体积分数为60%乙醇洗脱体积5 BV，体积分数为70%乙醇洗脱体积10 BV，流速2 BV/h，锁阳总黄酮纯度由9.83%升高至67.8%，其回收率为84.02%。因此，AB-8大孔树脂较适合分离纯化锁阳总黄酮。

总黄酮；大孔树脂；锁阳；分离纯化

锁阳（Cynomorium songaricumRupr.）是锁阳科锁阳属的单科单属单种植物，多寄生于蒺藜科（Zygophyllaceae）白刺属（NatrariaL.）植物根部，是全寄生种子植物［1］。主要产于甘肃、新疆、青海、内蒙古等干旱沙漠地带［2］。研究表明，锁阳在防癌、抗癌、免疫调节、延缓衰老、防治心血管疾病、治疗白细胞减少等方面也具有重要医疗价值［3］。近年来，锁阳系列产品的研究开发已取得突破性进展，涉及到医药、食品、发酵等各个方面：锁阳冲剂、锁阳胶囊、锁阳精、锁阳茶、锁阳饮片等，尤其是锁阳保健酒、锁阳啤酒、锁阳保健饮料和锁阳口服液的生产已实现了产业化。锁阳黄酮类化合物主要为儿茶素（catechin）、柑桔素4′-0-吡喃葡萄糖及一种以柑桔素为苷元的配糖体。研究表明，黄酮类化合物有明显的抗溃疡、抗菌、抗炎、降血脂等药用保健功能，能有效地清除自由基和脂质过氧化物，是一种具有广泛开发前景的天然抗氧化剂［4-6］。黄酮的分离纯化大多采用固-液萃取［7］、液-液萃取［8］、柱层析和高速逆流色谱等［9-11］，这些方法存在效率低、周期长、无法用于工业大批量生产等问题。大孔树脂利用树脂与生物物质分子之间相互作用力，实现生化物质与大量杂质分离，采用适当洗脱剂进行洗脱过程［12］，大孔树脂可重复利用，成本较低。

本实验是在筛选适宜的大孔树脂基础上，采用静态和动态实验摸索锁阳黄酮分离纯化的最适条件，为锁阳深加工提取理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

锁阳由甘肃省微藻技术研发中心提供；选用锁阳（Cynomorium songaricum）的干燥肉质茎，样品于50℃干燥至质量恒定，粉碎，过40目筛，密封保存备用。

芦丁对照品（纯度≥98%），No.100080-200306：国药集团化学试剂有限公司。所有试剂均为分析纯。NKA-9、NKA、D101、AB-8、HPD-750型大孔树脂5种树脂型号与特性见表1。

表1　大孔树脂的物理特性Table 1 Physical properties of macroporous resins

1.2仪器与设备

SP-721分光光度计：上海光谱仪器有限公司；RE-2000A旋转真空蒸发器：河南巩义金华仪器有限公司；GM-0.33A隔膜真空泵：深圳市瑞鑫达化玻仪器有限公司；BSD-YF2200立式双层智能精密型摇床：上海西箭仪器设备有限公司。

1.3方法

1.3.1黄酮粗提物制备

称取一定量锁阳粉末，按照1∶50（g∶mL）料液比加入体积分数95%的乙醇，在60℃浸提2 h，3 000 r/min离心5 min，将上清液减压浓缩、干燥后备用。

1.3.2总黄酮含量的测定

总黄酮含量的测定采用分光光度法。

芦丁标准曲线的制备：称取一定量芦丁标准品，用体积分数50%乙醇溶液配制成黄酮质量浓度为1 mg/mL的乙醇溶液。分别精确吸0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6 mL于6个10 mL于棕色容量瓶中，加入质量分数5%亚硝酸钠溶液0.3mL，混匀静置6min，再加入10%硝酸铝0.3mL，摇匀，静置6 min，再加入4 mL质量分数为4%氢氧化钠溶液，用水定容至刻度，静置15 min，以试剂空白作参照，在波长510 nm处测吸光度值［13］，以芦丁含量（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制芦丁标准曲线，得回归方程为：y=1.245x-0.002 4，相关系数R2=0.999 2。按照标准曲线回归方程计算样品中总黄酮含量。

1.3.3树脂的预处理

用体积分数95%乙醇浸泡5种树脂（NKA-9、NKA、D101、AB-8、HPD-750），倾去上浮的杂质，先用1 mol/L HCl浸泡12 h，用蒸馏水去酸，然后用1 mol/L NaOH溶液浸泡12 h，用蒸馏水去碱，抽滤，得抽干树脂。

1.3.4不同树脂静态吸附量、解吸量和解吸率的测定

准确称取抽干的5种树脂各1 g。分别加入5.37 mg/mL锁阳黄酮水溶液50 mL，置于25℃恒温摇床以150 r/min振荡24 h，测定锁阳黄酮含量，分别按式（1）计算各种树脂室温条件下的静态吸附量。再向已吸附完全的5种树脂分别加入体积分数为70%乙醇溶液进行洗脱，以150 r/min摇床解吸12 h后，测定锁阳总黄酮质量浓度，再根据式（2）、（3）计算解吸量和解吸率。最后选择适合吸附锁阳黄酮的树脂。

式中：Qe为吸附量，mg/g；C0为初始质量浓度，mg/mL；Ce为平衡质量浓度，mg/mL；Vi为加入的原液体积，mL；W为树脂用量，g；Qd为解吸量，%；D为解吸率，%；Cd为洗脱液质量浓度，mg/mL；Vd为洗脱液体积，mL。

1.3.5吸附液pH值的选择

准确称取抽干的树脂1g于三角瓶中，分别加入不同pH值的锁阳黄酮溶液，测定锁阳总黄酮的静态吸附量，选择适合上样的pH值。

1.3.6静态动力学试验

将筛选的1 g树脂于三角瓶中，加入30 mL 5.37 mg/mL锁阳黄酮水溶液，置于25℃恒温摇床150 r/min振荡12 h，每隔1 h测其总黄酮含量，利用式（4）计算吸附量，绘制静态吸附动力学曲线。

1.3.7大孔树脂吸附等温线的制作

分别称取预处理后树脂1 g于三角瓶中，依次加入不同质量浓度的锁阳黄酮溶液，分别在不同温度（25℃、30℃、35℃）摇床振荡150 r/min。待吸附饱和后，测其锁阳总黄酮的质量浓度，计算其静态吸附量；以树脂吸附量和吸附平衡液相总黄酮质量浓度作图，绘制不同温度条件下吸附等温线。用Langmuir公式和Freundlich［14］公式对锁阳总黄酮的吸附等温线进行拟合。

Langmuir等温方程：

Freundlich等温方程：

式中：Qe为吸附量，mg/g；Ce为平衡质量浓度，mg/mL；Qm为每克湿树脂的最大吸附量，mg/g；KL为吸附平衡常数；KF、n为常数。

1.3.8大孔树脂对锁阳总黄酮的动态吸附、解吸实验

取所选树脂湿法装柱（17mm×120mm），树脂的柱体积（bed volume，BV）为10 mL，锁阳总黄酮提取液以2.0 BV/h流速通过吸附柱，每隔1 BV测定流出液中总黄酮的质量浓度，绘制泄露曲线。上样结束后用蒸馏水冲洗，以便洗下树脂中未结合的的杂质。然后采用不同质量浓度的乙醇溶液以2.0 BV/h的速度洗脱层析柱，收集洗脱液，测定洗脱液中总黄酮纯度，计算回收率。计算公式如下：

2　结果与分析

2.1树脂静态吸附试验结果

2.1.1不同树脂吸附量、解吸量和解吸率的测定

表2　不同树脂的静态吸附与解吸特性比较Table 2 Comparison of static adsorption and desorption characteristics of different resins

由表2可知，D101、AB-8和HPD-750型树脂的吸附效果较好，吸附量分别96.9 mg/g、98.6 mg/g和84.3 mg/g。但D101、HPD-750的解吸量和解吸率较低，说明树脂与锁阳总黄酮结合能力较强，不利于总黄酮的洗脱；因此，选用AB-8大孔吸附树脂来进行后续试验。

2.1.2pH值对吸附的影响

图1　锁阳黄酮溶液pH值对吸附量的影响Fig.1 Effect of pH on the adsorption capacity

由图1可知，酸性条件易于锁阳黄酮的吸附。其原因可能是黄酮类化合物酚羟基在酸性条件下未解离，主要以范德华力与树脂进行物理吸附。而在碱性条件下，以黄酮类化合物可能以解离形式存在，与树脂吸附较难，因此选择黄酮溶液pH值为5。

2.1.3AB-8大孔吸附树脂的静态吸附动力学过程

由图2可知，随着时间逐渐增加，AB-8树脂对锁阳黄酮吸附量逐渐上升，当吸附时间为6 h时，吸附达到最大值［15］，随后锁阳黄酮吸附量趋于平衡。因此AB-8大孔吸附树脂的静态平衡吸附时间为6 h。

图2　AB-8大孔吸附树脂的静态吸附黄酮动力学曲线Fig.2 Adsorption kinetics curve for the total flavonoids on AB-8 resin

2.1.4AB-8大孔吸附树脂吸附等温线的测定

分别在3种不同温度下测量AB-8树脂在不同质量浓度锁阳黄酮溶液中（2.2 mg/mL、2.6 mg/mL、3.2 mg/mL、3.9 mg/mL、4.5 mg/mL）的吸附量，结果见图3。由图3可知，在质量浓度恒定条件下，温度升高，吸附量反而降低，说明低温条件利于进行吸附；因此，在实验条件范围内室温更有利于吸附的进行。当锁阳黄酮质量浓度为3.9 mg/mL时，AB-8树脂对锁阳黄酮吸附效果较好。所以后续试验选择锁阳黄酮质量浓度为3.9 mg/mL上样。

图3　不同温度下AB-8吸附水溶液中锁阳总黄酮的吸附等温线Fig.3 Adsorption isotherms of the total flavonoids fromC.songaricum in AB-8 resin aqueous solution at different temperature

吸附等温线是表征不同物质吸附的特征曲线，Langmuir方程建立在单分子吸附基础上，而Freundlich方程可阐述单层和多层吸附行为［16］。将不同温度条件下测量AB-8树脂在不同质量浓度锁阳黄酮溶液中的吸附量，采用Langmuir和Freundlich方程拟合曲线，得到的方程参数见表3。

表3　两种模型方程拟合结果及参数Table 3 The fitting results and parameters of two model equation

由表3可知，Langmuir相关系数R2比Freundlich相关系数要高，并且在25℃达到0.997 3，说明Langmuir模型更适用于分析AB-8树脂吸附锁阳黄酮。在Freundlich方程中1/n的值在0.1～0.5范围内时，吸附较易进行，从表3可知，AB-8树脂吸附锁阳黄酮时的1/n值为0.3～0.5之间，说明该吸附反应较易进行。

2.2树脂动态泄露曲线的测定

检测了AB-8大孔树脂的动态泄露曲线，每1 BV检测一次流出液中的黄酮含量。由图4可知，当流出液在6 BV之内，流出液中无黄酮露出，当流出液为8 BV时，流出液中黄酮含量快速增加。所以选择最佳上样体积为5 BV。

图4　AB-8吸附锁阳黄酮的动态泄露曲线Fig.4 Dynamic breakthrough curves of total flavonoids from C.songaricumby AB-8 resin

2.3AB-8树脂动态解吸的测定

AB-8树脂湿法装柱，在最佳条件下上柱，先用5 BV蒸馏水以2 BV/h的体积流量除杂至流出液为无色，再依次用5 BV和10 BV一定体积分数的乙醇以2 BV/h的体积流量上柱洗脱，收集各洗脱液，检测其中总黄酮含量，计算回收率，结果见表4。由表4可知，当体积分数为30%乙醇洗脱液上柱洗脱时，总浸膏量较多，但总黄酮不存在，说明总黄酮与树脂之间吸附能力较强，当体积分数为60%～70%乙醇洗脱时，总黄酮纯度较高。因此采用蒸馏水冲洗后，收集60%～70%的乙醇洗脱部分。

表4　不同洗脱剂对总黄酮解吸的影响Table 4 Effect of different eluent on the desorption of total flavonoids

2.4最佳工艺稳定性试验

取3.9 mg/mL的锁阳黄酮粗提液，以2 BV/h流速上样，后续采用5 BV蒸馏水和体积分数为30%乙醇冲洗杂质，采用体积分数为60%乙醇5 BV洗脱，再用体积分数为70%乙醇10 BV洗脱，测定洗脱液中总黄酮含量，浓缩干燥，计算浸膏中总黄酮回收率。结果显示锁阳总黄酮纯度由9.83%升高至67.8%，其回收率为84.02%。

3　结论

本实验考察5种大孔吸附树脂对锁阳总黄酮进行静态吸附、解吸筛选，结果表明AB-8树脂具有较好静态吸附及解吸效果。纯化条件为取质量浓度为3.9 mg/mL的锁阳黄酮粗提水溶液150 mL，2 BV/h流速上样，体积5 BV；吸附平衡后，5 BV蒸馏水和5 BV体积分数为30%乙醇冲洗杂质；采用体积分数为60%乙醇5 BV洗脱，再用体积分数为70%乙醇10 BV洗脱，收集洗脱液浓缩、干燥，锁阳黄酮提取液中总黄酮的纯度由9.83%升高至67.8%，其回收率为84.02%。而张庭瑞等［17］采用AB-8树脂纯化锁阳总黄酮时仅用体积分数为70%乙醇洗脱，回收率为64.88%。研究结果表明了AB-8大孔树脂对锁阳总黄酮是实际可行的，可为锁阳总黄酮大规模纯化提供理论依据。

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Separation and purification of total flavones fromCynomorium songaricumby macroporous resins macroporous resins

ZHANG Xifeng1，LUO Guanghong2，WANG Chunhui1*
（1.College of Agriculture and Biotechnology，Hexi University，Zhangye 734000，China；2.Microalgae Engineering Research Center of Gansu Province，Kaiyuan Bio-Tech Development Center，Hexi University，Zhangye 734000，China）

In order to isolate and purify the total flavonoids fromCynomorium songaricum，comparing with static adsorption process of 5 kinds of macroporous resins，and the suitable resin was determined.The results showed that AB-8 resin was the optimal due to its highest separation and purification of the total flavonoids fromC.songaricumand its adsorption process could be described by the Langmuir and Freundlich isotherms.The optimum adsorption conditions were solution concentration 3.9 mg/ml，pH 5.0，adsorbed volume 5 BV，flow velocity 2 BV/h，temperature 25℃.The optimum elution conditions were 60%ethanol 5 BV，70%ethanol 10 BV，flow velocity 2 BV/h.Under this condition，the content ofC.songaricum total flavonoids increased from 9.83%to 67.8%，and the recovery rate was 84.02%.AB-8 resin was suitable for the separation and purification of the total flavonoids fromC.songaricum.

total flavonoids；macroporous resins；Cynomorium songaricum；separation and purification

S567.9

A

0254-5071（2015）10-0106-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.024

2015-09-02

河西学院科研创新与应用校长基金项目（No.XZ2014-29）；甘肃省中小企业创新基金项目（1047GCCG001）

张喜峰（1982-），男，讲师，硕士，研究方向为天然产物分离纯化。

王春晖（1977-），男，讲师，本科，研究方向为食品化学。