娄利娇,胡 萍*,湛剑龙,张玉龙,樊 敏(贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳550025)
分离自贵州侗族苗族发酵肉中两株乳酸菌的耐受特性分析
娄利娇,胡萍*,湛剑龙,张玉龙,樊敏
(贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳550025)
该试验对分离自贵州侗族苗族发酵肉中的弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)LAB26(SR6)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)LAB42(SR10-1)的耐受能力进行了研究。结果显示,2株乳酸菌均表现出良好的耐酸、耐渗透压、耐亚硝酸盐及人工模拟胃肠液耐受能力。2株乳酸菌均可在pH值为3.5的环境中生长良好,其中菌株SR6在pH值为1.5的环境中仍有生长,表现出较好的耐酸性;2株乳酸菌均可在8%NaCl溶液的环境中生长良好;2株乳酸菌在0~0.04%NaNO2条件下,代谢活跃,正常生长;2株乳酸菌在经过人工模拟胃肠液处理3 h后,活菌数仍≥5.0×107CFU/mL。表明弯曲乳杆菌LAB26与戊糖片球菌LAB42均表现出良好的耐受性,可用于功能型食品的开发。
发酵肉;弯曲乳杆菌;戊糖片球菌;乳酸菌;耐受特性
贵州侗族苗族发酵肉制品以“酸”为特色,主要以猪肉和鱼肉为原料,根据当地饮食习惯添加甜米酒、糯米饭、生姜、大蒜,花椒粉、辣椒粉等辅料,采用自然发酵法进行发酵制作,很好地保存了当地自然环境中的有益微生物(主要是乳酸菌),不仅具有制作方式独特、用料天然、风味特殊(鲜、香、酸、辣)、贮存时间长等特点,还具有抗氧化、降胆固醇等益生作用[1-2]。近年来,发酵肉制品在国际上已作为功能性食品基料在食品工业及医疗的许多方面获得了广泛应用[3]。乳酸菌是研究、应用较广泛的益生菌之一,也是发酵肉制品中的优势菌群。研究报道,乳酸菌具有抗氧化、降胆固醇、降血压、调节肠道微生态等多种益生作用。但是,乳酸菌需要抵抗机体胃肠道的不良环境后才能发挥其益生功能。人体胃液的pH变化较大,正常胃液的pH值约为3.0,空腹或者食用酸性食物时,pH值约为1.5[4],且胃部还含有胃蛋白酶等抑菌物质,低pH环境及胃蛋白酶等抑菌物质会阻碍乳酸菌的生长,并阻碍其进入肠道发挥其益生作用。因此,乳酸菌的耐酸、耐盐等耐受能力及其对胃肠道的耐受能力,也是评价其菌种优良的重要指标之一[5-6]。该实验中的受试菌株弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)LAB26(SR6)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)LAB42(SR10-1)[7],均为实验室从贵州侗族苗族酸鱼、酸肉中的乳酸菌进行筛选所得,结果显示这两株乳酸菌具有较好的抗氧化作用[8-9]。本实验对这两株乳酸菌的耐酸、耐盐、耐亚硝酸盐能力及人工模拟胃肠道耐受能力进行研究,以期其具有良好的耐受能力,为生产具有良好益生作用的发酵肉制品提供参考依据。
1.1材料与试剂
1.1.1菌株来源
2株乳酸菌菌株SR6(弯曲乳杆菌LAB26)和SR10-1(戊糖片球菌LAB42):均源自实验室分离的贵州侗族苗族酸鱼、酸肉中的乳酸菌菌株。
1.1.2培养基
MRS液体培养基:称取55.2 g MRS培养基粉末,溶于1 000 mL蒸馏水中,调pH值至6.2,121℃灭菌15 min,备用。
MRS固体培养基:在MRS液体培养基中加1.8%的琼脂,加热溶解,调pH至6.2,121℃灭菌15 min,备用。
1.1.3试剂
胃蛋白酶(3 000 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg):北京索莱宝科技有限公司;实验所用其他化学试剂均为分析纯:市售。
1.2仪器与设备
超净工作台:苏州市金净净化设备科技有限公司;Micro17R微量高速冷冻离心机:美国Thermo Electron公司;T6新世纪紫外分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司;PHS-3C数显pH计:上海越平科学仪器有限公司;恒温振荡培养箱HZQ-X100:太仓市实验设备厂;数显电热培养箱HPX-9082 MEB:上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.3实验方法
1.3.1菌株24 h生长曲线及pH值的测定
将已活化的2株受试菌以3%接种量分别接种于MRS液体培养基中,在37℃、150r/min条件下摇床培养24h,每隔2 h取发酵液,在波长600 nm处测定其吸光度值(OD600nm)及pH值,以空白MRS液体培养基作为对照,平行测试3次,绘制菌株生长曲线及24 h pH值变化曲线。
1.3.2菌株耐酸能力的测定
将已活化的2株受试菌,以3%接种量分别接种于pH值分别为1.5、2.5、3.5、4.5、6.5[10]的MRS液体培养基中,置于37℃培养,分别于0、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h取发酵液,在波长600 nm处测定其吸光度值(OD600nm),以各自对应pH值的空白MRS液体培养基作为对照,平行测试3次。
1.3.3菌株耐渗透压能力的测定
将已活化的2株受试菌,以3%接种量分别接种于NaCl含量为0、2%、4%、6%、8%的MRS液体培养基中,置于37℃培养,分别于0、2h、4h、6h、8h、24h取发酵液,在波长600nm处测定其吸光度值(OD600nm),以各自对应NaCl含量的空白MRS液体培养基作为对照,平行测试3次。
1.3.4菌株耐亚硝酸盐能力的测定
将已活化的2株受试菌,以3%接种量分别接种于NaNO2含量为0、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%的MRS液体培养基中,置于37℃培养,分别于0、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h取发酵液,在波长600 nm处测定其吸光度值(OD600nm),以各自对应NaNO2含量的空白MRS液体培养基作为对照,平行测试3次。
1.3.5人工模拟胃肠液耐受试验[11]
(1)人工模拟胃液的配制
采用《中华人民共和国药典》(2010版)中的方法稍有改进。取稀盐酸(0.1 mol/L)16.4 mL,加蒸馏水稀释至1 000 mL,121℃灭菌15 min。取100 mL上述液体,加1 g胃蛋白酶,充分溶解后,用微孔滤膜(孔径0.20 μm)过滤除菌,备用。
(2)人工模拟肠液的配制
采用《中华人民共和国药典》(2010版)中的方法稍有改进。取KH2PO46.8g,加蒸馏水500mL溶解,用质量浓度为4 g/L的NaOH溶液调pH值至6.8,加水稀释至1 000 mL,121℃灭菌15 min。取100 mL上述液体,加1 g胰蛋白酶,充分溶解后,用微孔滤膜(孔径0.20 μm)过滤除菌,备用。
(3)体外人工模拟胃肠道消化试验
乳酸菌发挥其功能特性的菌体浓度一般为106~109CFU/mL[12-15],该试验采用的菌体浓度为109CFU/mL。将已活化的2株受试菌菌株,以3%接种量分别接种于MRS液体培养基中,37℃静置培养18 h,3 500 r/min离心10 min,收集菌体,菌体经无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)洗涤3次后重悬于PBS中,调整菌体浓度为109CFU/mL,备用。
准确移取上述菌悬液1mL,在无菌操作下,置于150 mL灭菌锥形瓶中,加入20 mL人工胃液,同时将瓶子放入恒温振荡摇床37℃、90 r/min培养1 h。然后加入80 mL人工肠液,37℃,120 r/min继续培养2 h。吸取1 mL培养后的菌悬液于9 mL生理盐水中作系列梯度稀释,稀释到合适的浓度梯度,涂布于MRS平板上,采用平板菌落计数法进行活菌计数。
(4)活菌计数及耐受率计算乳酸菌活菌计数采用平板菌落计数法[16]。人工模拟胃肠道耐受率计算公式如下:
2.1菌株24 h生长曲线及pH值变化的结果
乳酸菌生长曲线可反映乳酸菌的菌体数量、生长状况及代谢情况等多个重要指标,同时测定菌株发酵液的pH值,可初步判定菌株的产酸能力。对2株乳酸菌SR6和SR10-1进行了24 h生长曲线的绘制及pH值的测定,结果分别如图1、图2所示。
由图1可知,菌株SR6和SR10-1的培养时间与OD600nm值均呈正比关系,且变化趋势相似。在0~8 h内,OD600nm值开始缓慢上升,菌体细胞开始缓慢生长;8 h后,OD600nm值呈直线上升,菌体细胞快速生长繁殖,代谢活跃,进入对数期;到18 h时曲线趋于平缓,20 h达到生长高峰,此时菌体细胞的生长速率与死亡速率处于动态平衡,开始积累代谢产物;在整个培养过程中,菌株SR6吸光度值始终高于菌株SR10-1,说明菌株SR6生长状况优于菌株SR10-1。通过生长曲线可以初步确定,菌株SR6与菌株SR10-1的菌体最佳收集时间为18~20 h。
图1 菌株SR6、SR10-1的24 h生长曲线Fig.1 Growth curve of strain SR6 and SR10-1 in 24 h
图2 菌株SR6、SR10-1的24 h pH值变化Fig.2 Change of pH value of strain SR6 and SR10-1 in 24 h
由图2可知,2株乳酸菌SR6和SR10-1培养24 h的pH值变化趋势相似,在0~4 h内pH值变化较小;4~18 h内,pH值下降明显,pH值由6.0下降至3.5左右,此时间段正值菌株对数生长期,乳酸菌开始产生乳酸、氨基酸等有机酸,使得pH值迅速下降;18 h后pH值趋于稳定,到24 h时培养液的pH值为3.3。说明2株乳酸菌均表现出良好的产酸能力,其24 h内的pH值动态变化与其生长曲线变化相符。
2.2菌株耐酸能力试验结果
食物通过胃液的时间一般为1~2 h,胃液的pH值变化对微生物的生长影响较大,且乳酸菌自身代谢产生的氨基酸、乳酸等有机酸也会改变其生长环境的pH值[10,17]。这就要求乳酸菌具有一定的耐酸能力。采用比浊法对2株乳酸菌SR6和SR10-1的耐酸能力进行了测定,结果如图3所示。
图3 菌株SR6(A)及SR10-1(B)在不同pH值和时间条件下的OD600nm值Fig.3 The OD600nmvalue of strain SR6(A)and SR10-1(B)atdifferent pH and time
由图3可知,当培养基的pH值由6.5降至1.5时,同一菌株培养24 h后的OD600nm值逐渐减小,说明菌株的菌体浓度随着pH值的降低而减小;当pH值为3.5时,0~2 h内,2株菌的OD600nm值无变化,4 h后开始缓慢升高,菌株的菌体浓度逐渐增大;当pH值降至2.5后,菌株的OD600nm值几乎无变化,菌株培养24 h的菌体浓度略有增长,增长幅度小,说明菌体细胞的生长受到一定抑制。菌株SR6的菌体浓度在各pH值条件下均有增长,其增长幅度随pH值的降低而减小,在pH值低至1.5时仍有增长,但生长受到抑制;菌株SR10-1在pH值2.5、1.5时,菌株培养24 h后的菌体浓度略有增加,说明菌株的生长受到抑制或被杀死。有研究报道[18],嗜酸乳杆菌在pH值1.0的PBS缓冲液中培养1 h后,仍能存活。实验结果表明,两株乳酸菌在pH值为1.5的环境中仍有生长,均表现出良好的耐酸性。
2.3菌株耐渗透压能力试验结果
微生物对渗透压有一定的适应能力,若渗透压突然较大程度的升高或降低,会对微生物的生长有较大影响,甚至导致死亡。采用比浊法对2株乳酸菌SR6与SR10-1的耐渗透压能力进行测定,结果如图4所示。
由图4可知,2株乳酸菌SR6和SR10-1,在2%~8%NaCl条件下,菌体浓度随着培养时间的增加而增加;同一菌株培养24 h后的菌体浓度随着NaCl含量的增大而逐渐减小。2株菌在8%NaCl含量下均可生长;在同一NaCl含量下,菌株SR6的OD600nm值较SR10-1高,表明SR6的耐渗透压能力较SR10-1强。2菌株在8%NaCl环境中,0~8 h内的OD600nm值无变化,说明其生长受到抑制。有研究表明[19-20],乳酸菌可在含6%NaCl的MRS液体培养基中生长,有部分乳酸菌可以耐8%NaCl溶液。实验结果表明,2株乳酸菌SR6和SR10-1均具有良好的耐渗透压能力,其中菌株SR6的耐渗透压能力优于菌株SR10-1。
图4 菌株SR6(A)及SR10-1(B)在不同NaCl含量和时间条件下的OD600nm值Fig.4 The OD600nmvalue of strain SR6(A)and SR10-1(B)at different NaCl content and time
2.4菌株耐亚硝酸盐能力试验结果
乳酸菌常作为发酵剂被应用于制作发酵肉制品、乳制品及酸菜、泡菜等。在制作酸菜和泡菜的过程中,蔬菜自身带有的硝酸盐在微生物的作用下被转化为亚硝酸盐;在低温发酵肉制品加工过程中,常添加硝酸盐和亚硝酸盐作为发色剂和防腐剂。这就要求应用的乳酸菌要具有一定的耐亚硝酸盐能力。采用比浊法对2株乳酸菌SR6与SR10-1的耐亚硝酸盐能力进行了测定,结果如图5所示。
由图5可知,2株乳酸菌SR6和SR10-1在0~0.04% NaNO2含量条件下均生长良好,同一菌株在各NaNO2含量下培养24 h后的OD600nm值几乎无变化,表现出良好的耐亚硝酸盐能力。有研究表明[21-22],乳酸菌可降低食物中亚硝酸盐的生成量或直接降解食物中的亚硝酸盐;张庆芳等[23]对乳酸菌降解亚硝酸盐的机理进行研究发现,乳酸菌对亚硝酸盐的降解分为酶降解和酸降解2个阶段,培养液pH值>4.5时,以酶降解为主;培养液pH值<4.0时,以酸降解为主。
图5 菌株SR6(A)及SR10-1(B)在不同NaNO2含量和时间条件下的OD600nm值Fig.5 The OD600nmvalue of strain SR6(A)and SR10-1(B)at different NaNO2content and time
2.5人工模拟胃肠液试验结果
胃液具有强酸性,且含有胃蛋白酶等抑菌物质,小肠内含有胰蛋白酶等抑菌物质[10,24],因此,乳酸菌必须以活菌状态通过胃液,并能耐受肠液的不良环境才能发挥其益生功能。食物通过胃的时间一般为1~2 h,通过小肠的时间一般为2~3 h[25]。对2株乳酸菌进行人工模拟胃肠液耐受试验,结果如表1所示。
表1 菌株在人工模拟胃肠液环境中的存活数与耐受率Table 1 Survival number and tolerace rate of strains in artificial gastrointestinal fluid
由表1可知,两株菌在人工模拟消化液中的存活受到抑制,经消化液处理3 h后,活菌数明显下降,但两株菌的活菌数均维持在5×107CFU/mL以上,高于临界值106CFU/mL,其中菌株SR6的活菌数为(6.90±0.15)×107CFU/mL,菌株SR10-1的活菌数为(5.20±0.15)×107CFU/mL。经过3 h人工模拟胃肠液处理后,菌株SR6对模拟胃肠液的耐受率为5.70%,菌株SR10-1对模拟胃肠液的耐受率为3.64%。结果显示,2株乳酸菌在经过3 h胃肠道处理后仍有大量菌体存活,对胃肠道逆境均表现出良好的抵抗力,可起到良好的益生作用。
通过对弯曲乳杆菌LAB26与戊糖片球菌LAB42的耐受性进行研究,结果表明,2株乳酸菌不仅具有良好的生长性能,且对高酸度、高渗透压、高亚硝酸盐均表现出不同程度的耐受性。2菌株均可在高酸度环境下生长,且SR6在pH值为1.5的环境仍有生长,表现出较好的耐酸性;2菌株均可在高渗透压环境下生长,且SR6在8%NaCl含量环境下生长良好,表现出较好的耐渗透压能力;2菌株在0~0.04%NaNO2含量范围内均正常生长,且代谢活跃,表现出良好的亚硝酸盐耐受能力;经过人工胃肠液处理3 h后,2株菌在人工消化环境中具有良好的存活能力,活菌数均维持在5×107CFU/mL以上,可抵抗胃肠道逆境,表现出良好的耐受能力。从实验结果看来,菌株SR6的整体耐受能力优于菌株SR10-1。
本研究采用的弯曲乳杆菌LAB26与戊糖片球菌LAB42均表现出良好的耐受性,且2株菌也符合作为乳酸菌发酵功能食品菌种耐受胃肠道环境的要求,具有进一步研究应用的价值,在开发乳酸菌发酵功能食品方面也具有应用潜力。
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Tolerance property of two lactic acid bacteria isolated from fermented meat of Guizhou Dong and Miao
LOU Lijiao,HU Ping*,ZHAN Jianlong,ZHANG Yulong,FAN Min
(School of Liquor and Food Engineering,Gui Zhou University,Guiyang 550025,China)
Tolerance propertiesofLactobacillus curvatusLAB26(SR6)andPediococcus pentosaceusLAB42(SR10-1)from fermented meat of Guizhou Dongand Miao were researched.The results showed that two strains of lactic acid bacteria had good capacity,including acid-tolerance,NaCl-tolerance,NaNO2-tolerance and artificial gastrointestinal fluid tolerance and they could grow well at pH 3.5.The strain SR6 could still grow at pH 1.5 and it had good acid-tolerance capacity.The both strains could grow well at the conditions of 8%NaCl and the metabolism was active and theycan grow normally at the conditions of 0-0.04%NaNO2.The viable count of two strains in artificial gastrointestinal fluid after 3 h was both more than 5.0×107CFU/ml. The study indicated thatL.curvatusLAB26 andP.pentosaceusLAB42 both had good tolerance properties,and could be used for the development of functional foods.
fermented meat;Lactobacillus curvatus;Pediococcus pentosaceus;lactic acid bacteria;tolerance property
TS261.9
A
0254-5071(2015)11-0126-05
10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.029
2015-10-11
国家自然科学基金项目(31260379)
娄利娇(1989-),女,硕士研究生,研究方向为食品微生物与生物技术。
胡萍(1970-),女,教授,博士,研究方向为食品微生物与生物技术。