马奶酒发酵剂用菌种的筛选研究

GAN-OD NAMNANSUREN，徐　敏，霍贵成*（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

马奶酒发酵剂用菌种的筛选研究

GAN-OD NAMNANSUREN，徐敏，霍贵成*
（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

采用乳酸菌联合酵母的发酵方法，制备一种新型马奶酒并为工业化生产马奶酒提供新型发酵剂。通过考察8%酵母菌（F1）、6%酵母菌联合2%嗜酸乳杆菌（F2）、6%酵母菌联合2%瑞士乳杆菌（F3）、6%酵母菌联合1%嗜酸乳杆菌及1%瑞士乳杆菌（F4）以上四种发酵菌种配比，以酒精度、酸度、感官品质为考察指标，开发适合马奶酒工业化生产的优良发酵剂。结果表明，当采用6%酵母菌联合1%嗜酸乳杆菌及1%瑞士乳杆菌（F4）的发酵方式时，马奶酒酒精度为1.39%vol，马奶酒酸度为90°T，感官评分为91分，且马奶酒香醇可口、组织均匀，适于大众饮用；因此6%酵母菌联合1%嗜酸乳杆菌及1%瑞士乳杆菌，可作为工业化生产马奶酒所用的发酵剂。

乳酸菌；酵母；发酵剂；马奶酒

马奶酒是用鲜马奶经过发酵变酸酿制而成的饮料；其最早始于秦汉时代，历史悠久，味道酸辣，被称为元玉浆，是“蒙古八珍”之一［1］。马奶酒性温，有驱寒、舒筋、活血、健胃等功效［2］。传统的马奶酒是在鲜马奶中加入天然发酵剂，经自然发酵形成，呈乳白色的、质地均匀的饮料［3］。马奶酒作为一种中国特色饮料，逐渐受到大众的喜爱；随着人民生活节奏的不断加快，市场迫切需要将这种传统方便饮料工业化生产，其中发酵剂在马奶酒的加工过程中起着至关重要的作用［4］。然而，传统天然发酵剂很大程度上影响马奶酒的工业化生产；目前国外对于新发酵剂的开发很多依靠基因工程，但是其应用受到消费者和欧盟的阻碍［5］。因此，传统的筛选和鉴定方法对于马奶酒发酵剂的开发仍起着一定程度的作用［6］。根据文献，酵母菌联合乳酸菌制备马奶酒时，且酵母菌含量为2/3时，马奶酒品质较好［7-10］，因此该实验考察酵母菌（F1）、酵母菌联合嗜酸乳杆菌（F2）、酵母菌联合瑞士乳杆菌（F3）、酵母菌联合两种乳杆菌（F4）四种发酵剂，以酒精度、酸度、感官品质为评价指标，开发适合马奶酒工业化生产的优良发酵剂。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种及来源

本研究选择接种比例为：F1（酵母菌8%）；F2（酵母菌6%∶嗜酸乳杆菌2%）；F3（酵母菌6%∶瑞士乳杆菌2%）；F4（酵母菌6%∶嗜酸乳杆菌1%∶瑞士乳杆菌1%）。

酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）：市售；嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）：乳品科学教育部重点实验室。

1.1.2培养基

MRS培养基：蛋白胨5 g、牛肉膏5 g、酵母粉5 g、胰蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、吐温-80 1.1 g、磷酸氢二钾2 g、柠檬酸氢二氨2 g、乙酸钠5 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25 g，蒸馏水950 mL。固体培养基添加1.6%的琼脂粉，121℃高压灭菌15 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL。

1.1.3主要试剂

蛋白胨、牛肉膏：北京奥博星生物技术有限公司；胰蛋白胨、酵母粉：英国OXOID公司；葡萄糖：天津光复科技发展有限公司；磷酸氢二钾：天津光复科技发展有限公司；硫酸锰、柠檬酸氢二胺、乙酸钠（均为分析纯）：天津东丽区天大化学仪器厂；Tween-80：天津光复精细化工研究所；营养琼脂：天津光复科技发展有限公司。

1.2仪器与设备

DU800紫外可见分光光度计：美国BECKMAN公司；GL-21M离心机：上海市离心机械研究所；DHP-9272电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；PL2002电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HVE-50全自动高压灭菌锅：日本HIRAYAMA公司；XK96-A快速混匀器：姜堰市新康医疗器械有限公司。

1.3试验方法

1.3.1新型马奶酒生产工艺流程

1.3.2操作要点

（1）马奶的验收：产自健康奶牛乳房，细菌数低、体细胞数低、乳成分正常、无抗生素残留、无沉淀物和异味、不掺水的自然马乳；验收后4℃保存备用［11］。

（2）菌种的活化：将从-20℃冰箱中取出乳酸菌及酵母菌粉，以2%的接种量分别接种到5mL的液体培养基中进行活化，37℃培养14 h后，用混匀器将培养液充分混匀，用接种环在培养液中轻沾少许液体，在固体培养基上进行三区划线，然后进行培养［12］。

（3）乳酸菌发酵液的制备：将-20℃冰箱保存的嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌取出，分别接种于MRS液体培养基内，37℃培养24 h，传代2～3次后，取稳定期初的嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌菌液，于4℃储存，备用。

（4）酵母发酵液的制备：无菌环境下将酵母菌接种于YPD培养基中活化，置于28℃培养48 h，于4℃储存，备用。

考虑到乳酸菌及酵母菌的最适生长温度及其生长曲线，马奶酒的发酵温度定为37～40℃，发酵时间定为12～14h。

1.3.3菌体及菌落形态的观察及生长曲线测定

菌株在MRS固体培养基上培养24 h后，选取一个较大菌落，挑取其中的1/2菌落，进行革兰氏染色和淮镜观察，并照相；酵母菌原理同上。

用接种环挑取另外的1/2菌落，接种于MRS液体培养基中，培养约14 h，以2%的接种量接种于MRS液体培养基中，培养约14 h时，再以2%接种量分别接种于54个盛有MRS液体培养基的试管中，并在54个试管分别标上0、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h、26 h、28 h、30 h（共18个时间段，每个时间段3个平行），37℃恒温培养，从起点开始计时当，到达上述时间时，将对应的3支试管取出放入4℃冰箱中，待18个时间段全部取出后一起用紫外分光光度计测定吸光度值；采用梯度平板稀释法测定0～30 h内的活菌数，重复3次，作生长曲线。酵母菌原理同上。

1.3.4分析测定方法

酒精度的测定用酒精计进行测定；酸度测定用酸碱滴定法进行测定［2-4］。

1.3.5马奶酒感官的评定

采用综合评分法，在有明亮自然光、温度为25℃的房间内进行马奶酒感官评定。根据口感（35分），香味（35分），组织状态（20分），色泽（10分）进行综合评分，满分100分［14-15］。评定方法：随机选取50名性别不同、年龄各异、语言表达能力强的人员进行感官评价，排除偏差，试验结果取平均值，然后进行分析，马奶酒的感官评分标准见表1。

表1　马奶酒的感官评分标准Table1 Sensory evaluation standards of kumiss

2　结果与分析

2.1菌株生长曲线

分别将三株菌接种于液体培养基中，以培养时间为横坐标，OD600nm值为纵坐标，绘制3株菌的生长曲线，结果见图1。

由图1可知，瑞士乳杆菌在培养4 h时开始迅速生长，进入生长的对数期，在16 h后进入生长的相对稳定期，菌体生长缓慢，瑞士乳杆菌在28 h时进入衰退期；嗜酸乳杆菌在3 h时开始迅速生长，进入生长的对数期，14 h进入稳定期，未检测出衰退期；酵母菌在培养2 h时开始迅速生长，进入生长的对数期，在14 h后进入生长的相对稳定期，菌体生长缓慢，酵母菌在28 h时进入衰退期。因此，本研究发酵制备马奶酒采用三株菌的发酵时间分别为：瑞士乳杆菌为16 h，嗜酸乳杆菌为14 h，酵母菌为14 h。

图1三株菌的生长曲线
Fig. 1 Growth curves of three strains

2.2不同菌株发酵过程对马奶酒酒精度的影响

在马奶酒生产中，除了酵母菌及根据需要所接种的微生物外，还有其他多种微生物的作用，如作为糖化曲的乳酸菌菌种。其中，酵母菌的主要作用是参与酒精发酵。不同菌种发酵对马奶酒酒精度的影响结果见图2。由图2可知，当酵母菌所占的比例较少时，马奶酒的酒精含量较低，酒精积累量随添加酵母菌比例的增大而升高，当酵母菌接种量为8%时，马奶酒的酒精含量最高为1.69%vol，说明大量的糖与酸都转化成了酒精；然而，6%酵母菌联合2%嗜酸乳杆菌（F2）与6%酵母菌联合2%瑞士乳杆菌（F3）和6%酵母菌联合1%嗜酸乳杆菌及1%瑞士乳杆菌（F4）所得的产品酒精度差异显著（P＜0.05）。

图2　不同发酵方式对马奶酒酒精度的影响Fig.2 Effect of different fermentation methods on alcohol content of kumiss

2.3不同菌株发酵过程对马奶酒酸度的影响

酵母菌进行酒精发酵后，乳酸菌（如植物乳杆菌、瑞士乳杆菌）可以进一步的以L-苹果酸为底物通过苹果酸-乳酸酶将其转化为L-乳酸；马奶酒的酸性物质主要由乳酸菌产生，乳酸菌除产生乳酸外，还产生少量的乙酸、甲酸、丙酸等酸性物质。不同菌种发酵对马奶酒酸度的影响结果见图3。由图3可以看出，当接种菌种全部为酵母菌时，马奶酒的酸度最低，随着乳酸菌的接入，马奶酒的酸度增大，可能是由于乳酸菌发酵产生了乳酸，降低了马奶酒的酸度。当接种6%酵母菌联合1%嗜酸乳杆菌及1%瑞士乳杆菌（F4）时，马奶酒的酸度达到最大，达到90°T，接种6%酵母菌联合2%嗜酸乳杆菌（F2）、与6%酵母菌联合2%瑞士乳杆菌（F3）两种发酵方式所得的马奶酒酸度次之，且无显著差异。

图3　不同发酵方式对马奶酒酸度的影响Fig.3 Effect of different fermentation methods on the acidity of kumiss

2.4不同菌株发酵过程对马奶酒品质的影响

图4　不同发酵方式对马奶酒感官评分的影响Fig.4 Effect of different fermentation methods on the sensory evaluation score of kumiss

由于乳酸菌的代谢会改变酒中醛类、酯类、氨基酸、维生素等微量成分的含量及呈香物质的含量。并且，乳酸菌还会产生一些微量的醇、醛、酯、酚等呈香物质。发酵过程的主发酵期主要是高温乳酸菌生长、代谢，后发酵期主要是低温乳酸菌的作用，这时部分高温乳酸菌死亡、自溶，给酵母菌和低温乳酸菌提供营养，也就是乳酸菌与酵母菌相互作用，推动马奶酒发酵，增强马奶酒口味的丰满性和浓厚感，形成马奶酒优良的品质。不同菌种发酵对马奶酒酸度的影响结果见图4，由图4可以看出，酵母菌接种量为8%时，马奶酒的感官评分较低，显著差别于接种6%酵母菌联合2%嗜酸乳杆菌（F2）、6%酵母菌联合2%瑞士乳杆菌（F3）、6%酵母菌联合1%嗜酸乳杆菌及1%瑞士乳杆菌（F4），其中，F2、F3、F4三种马奶酒的发酵方式之间感官评分差异不显著，以6%酵母菌联合1%嗜酸乳杆菌及1%瑞士乳杆菌（F4）的发酵方式制出的马奶酒感官评分最高，达91分。

3　结论

在马奶酒的生产中，发酵剂的主要作用是产酸、产酒精，以及改善马奶酒的质构及促进风味物质形成，因此选择合适的发酵剂对马奶酒的工业化生产尤为重要。通过对菌株一定程度的活化、培养，得到最佳状态的酵母菌、嗜酸乳杆菌及瑞士乳杆菌，然后综合不同指标，如产酒精度、产酸及马奶酒感官品质，研究不同发酵方式对马奶酒的影响，从而筛选出最佳马奶酒发酵剂。试验结果表明，当发酵剂为F4（即6%酵母菌联合1%嗜酸乳杆菌及1%瑞士乳杆菌）时，马奶酒酒精度为1.39%vol，马奶酒酸度为90°T，感官评分达到91分，且马奶酒品质最佳，因此，确定马奶酒工业化生产发酵剂为6%酵母菌联合1%嗜酸乳杆菌及1%瑞士乳杆菌。

［1］单艺，张兰威，崔宏斌.传统法酿造糯米酒中酵母菌的筛选及发酵特性研究［J］.食品工业科技，2007，28（8）：88-90.

［2］张和平，孙天松，郝林科，等.利用开菲尔发酵剂制备牛乳酸马奶酒的研究［J］.中国乳品工业，1996，24（4）：16-20.

［3］刘慧，虎砚颖，周雨，等.功能性开菲尔牛乳酸马奶酒的最佳发酵条件［J］.食品工业，2004（1）：35-37.

［4］田芬，陈俊亮，粘靖祺，等.嗜酸乳杆菌和双歧杆菌益生特性的研究［J］.食品工业科技，2012，33（7）：139-142.

［5］秦立虎，周密.我国马奶酒制作方法的历史沿革［J］.中国乳品工业，1996，24（6）：32-33.

［6］华朝丽，赵征.瑞士乳杆菌、丁二酮乳链球菌混合培养制作酮香型酸奶的研究［J］.中国乳品工业，2004，32（2）：17-20.

［7］闵建，李理.瑞士乳杆菌与干酪乳杆菌在不同原料中的发酵特性研究［J］.现代食品科技，2009，25（11）：1269-1274.

［8］王友湘，陈庆森.瑞士乳杆菌对小鼠肠道微生物区系的影响［J］.食品科学，2008，29（9）：542-546.

［9］杨印民.蒙元时期的葡萄酒和马奶酒［J］.历史教学问题，2007，22（4）：75-78.

［10］赵瑞香，王大红，牛生洋，等.超声波细胞破碎法检测嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶活力的研究［J］.食品科学，2006，27（1）：47-50.

［11］贺银凤，王锂韫，李少英，等.酸马奶酒中一株粪肠球菌抑菌物质的粗提及特性研究［J］.农业工程学报，2007，23（1）：264-267.

［12］敖道夫，布日额.酸马奶酒的研究进展［J］.中国民族医药杂志，2008，22（4）：65-67.

［13］殷文政，刘立一，马玉玲，等.马奶酒抑菌活性的研究［J］.中国乳品工业，2005，33（7）：15-17.

［14］徐敏，杜金城，于上富，等.藏式酥淮茶生产工艺研究［J］.食品研究与开发，2015，36（18）：72-75.

［15］徐敏，田辉，杜金城，等.多菌种共固定化发酵制备枸杞红枣乳酸饮料［J］.中国酿造，2015，34（7）：164-167.

Screening of starter culture of kumiss

GAN-OD NAMNANSUREN，XU Min，HUO Guicheng*
（College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Using lactic acid bacteria and yeast co-fermentation method，a new kind of kumiss was developed and new starter was prepared for industrial production.The effect of four starter culture inoculums：yeast 8%（F1），yeast 6%andLactobacillus acidophilus2%（F2），yeast 6%andLactobacillus helveticus2%（F3），and yeast 6%withL.acidophilus1%andL.helveticus1%（F4）on alcohol content，acidity and sensory evaluation quality was investigated.Results showed that when using yeast 6%withL.acidophilus1%andL.helveticus1%as starter，the alcohol content of kumiss was 1.39%vol，the acidity was 90°T，and the sensory evaluation score was 91.The product was sweet and delicious，the organization was uniform which was suitable for people.So yeast 6%withL.acidophilus1%andL.helveticus1%was the optimal starter for kumiss.

lactic acid bacteria；yeast；starter；kumiss

TS261.1

A

0254-5071（2015）11-0095-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.022

2015-10-10

农业部公益性行业（农业）科研专项（201203009）

GAN-OD NAMNANSUREN（1986-），男，硕士研究生，研究方向为食品科学。

霍贵成（1958-），男，教授，博士，研究方向为食品科学。