绿色木霉和酿酒酵母降解稻草转化为乙醇的研究

吕继良，陈傲玉，王　振（湖北理工学院环境科学与工程学院，湖北黄石435003）

绿色木霉和酿酒酵母降解稻草转化为乙醇的研究

吕继良，陈傲玉，王振
（湖北理工学院环境科学与工程学院，湖北黄石435003）

以稻草作为碳源、污泥作为氮源，利用绿色木霉（Trichoderma viride）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）降解稻草转化为乙醇，并对该过程中影响乙醇产量的因素进行优化。结果表明，当预处理稻草与预处理污泥质量比为1∶10（g∶g）、降解培养基初始pH值为7、绿色木霉和酿酒酵母的接种量分别为4%和3%、降解温度为37℃和降解时间为48 h时，可得到乙醇的含量为49.25 mg/L。

稻草；污泥；绿色木霉；酿酒酵母；乙醇

矿物质能源的消耗、枯竭以及长期使用造成的环境污染是全球面临的重要问题，开发新的可再生的绿色能源迫在眉睫。乙醇作为一种高效、清洁、可再生的能源成为最有潜力的替代能源之一。将乙醇作为含氧添加剂以一定比例添加到汽淮（柴淮）中，制成清洁环保的车用乙醇汽淮（乙醇柴淮），受到了世界各国的高度重视［1］。我国是一个农业大国，水稻是我国的主要农作物之一，每年随着水稻的丰收会产生大量的稻草，如果处理不当会造成环境污染。稻草主要成分为纤维素、半纤维素和木质素，可采用适宜技术将稻草中的纤维素转化成还原糖，进一步发酵可生成燃料乙醇。因为稻草中半纤维素和木质素与纤维素的复杂结构及纤维素分子高度结晶特性，限制了稻草转化为还原糖和燃料乙醇，所以需要进行适当的预处理，降低纤维素的结晶度，增加纤维素的多孔性，去除木质素的保护作用，减少酶的无效结合，增加酶与底物的接触位点和接触面积，从而提高酶解的效率［2-4］。

根据2014年第一季度住建部发布的通报，截至2014年3月底，全国累计建成城镇污水处理厂3 622座，污水处理能力约1.53亿m3/d，较2013年底新增约430万m3/d［5］。目前大部分国家污水处理厂采用活性污泥法，在我国超过85%的污水处理厂釆用活性污泥法［6］，活性污泥法会伴随产生大量污泥副产物，以含水率80%计，我国2010年污泥产生量约2 076万t，2011年污泥产生量超过3 000万t［7-10］。虽然污泥中含有会污染环境并威胁公众健康的重金属、病原微生物、寄生虫卵、盐类以及放射性核素等物质，但污泥中还存在大量的有机物质、丰富的氮、磷和多种微量元素等可利用物质，因此，对污泥进行资源化利用应是目前对污泥处置的最佳方法［11-12］。污泥中的大多数有机物存在于污泥絮体中，其是在胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）和阳离子的作用下将微生物细胞与有机物质、无机颗粒连接形成的絮状物质［13］。由于细胞壁及絮状体的阻隔，使胞内物质无法到达胞外被水解，影响厌氧消化过程中胞内物质的降解［14］。通过对污泥进行适当的预处理可以有效破坏微生物细胞壁，从而释放胞内的有机物质，同时还可降解细胞壁外的胞外聚合物（EPS），增加污泥液相中有机物的浓度［12］。

由于污泥中含有大量的含氮物质，稻草中含有大量的含碳物质，可分别作为微生物生长所需的氮源和碳源。若利用绿色木霉和酿酒酵母降解稻草，产纤维素酶的绿色木霉可将稻草中的纤维素降解成葡萄糖，酿酒酵母将葡萄糖发酵成乙醇，而污泥可提供绿色木霉和酿酒酵母生长所需的氮源等营养物质。这样不仅能够解决因稻草和污泥处理不当对环境造成的不利影响，而且能够将其资源化为可再生能源，实现经济社会的可持续发展。本研究主要是以稻草作为碳源、污泥作为氮源，利用绿色木霉（Trichoderma viride）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将稻草降解转化为乙醇，并对该过程中影响乙醇产量的因素进行优化，为微生物降解稻草转化为乙醇的工程放大及过程优化控制提供参考依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1材料

稻草：取自于贵州省茅台镇附近的村庄，将取来的稻草秸秆去除其根部和穗部，风干后，用微型粉碎机将其粉碎成能够通过40目筛但不能通过60目筛的粉末，贮于广口瓶中。

污泥：取自湖北省黄石市青山湖污水处理厂脱水后的干污泥，并将取来的污泥放置于阴暗处。

1.1.2菌种

绿色木霉（Trichoderma viride）：购于中国典型培养物保藏中心；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：购于中国工业微生物菌种保藏中心。

1.1.3培养基

保藏培养基A：土豆500g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，121℃灭菌30 min。

保藏培养基B：麦芽浸粉20 g/L，琼脂15 g/L，自然pH，121℃灭菌30 min。

种子培养基A：将保藏培养基A去除琼脂，121℃灭菌30 min。

种子培养基B：将保藏培养基B去除琼脂，121℃灭菌30 min。

降解培养基：未处理或预处理稻草若干，未处理或预处理污泥若干，调节至设定pH，121℃灭菌30 min。

1.1.4试剂

葡萄糖（分析纯）、重铬酸钾（分析纯）：天津博迪化工股份有限公司；麦芽浸粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂：青岛水产品加工厂；氢氧化钠（分析纯）、乙醇（分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；盐酸（分析纯）：中平能化集团开封东大化工有限公司；浓硫酸（分析纯）：信阳市化学试剂厂。

1.2仪器与设备

YM50立式压力蒸汽灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司；TS-200B气浴恒温振荡器：匡贝实业（上海）有限公司；SW-CJ-1D单人单面垂直送风净化工作台：杭州哈析仪器仪表有限公司；TD6M离心机：长沙平凡仪器仪表有限公司；UV-6100A紫外可见分光光度计：谨诚（北京）科技有限公司；FZ102微型植物粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；SE2001F电子天平：上海舜宇恒平科技仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：匡贝实业（上海）有限公司；XM-600烘箱：余姚市亚泰仪表有限公司；PHS-25pH测定仪：上海精密科学仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1稻草秸秆的碱预处理

称取20 g稻草粉末置于500 mL的大烧杯中，加入3.5% NaOH溶液400 mL（固液比为1∶20（g∶mL）），放置在数显恒温水浴锅中，100℃水浴加热35 min。然后用滤纸过滤，并用蒸馏水将滤饼洗涤至中性，将滤饼65℃烘干后，用于转化乙醇实验。

1.3.2污泥的碱预处理

在250mL锥形瓶中，加入5 g污水处理厂脱水后的干污泥，用1 mol/L NaOH溶液将污泥的pH值调节至12，然后将锥形瓶置于37℃、转速为110 r/min的气浴恒温振荡器中振荡24 h。用滤纸过滤，并用蒸馏水将滤饼洗涤至中性，将滤饼65℃烘干后，用于转化乙醇实验。

1.3.3菌种种子培养基的制备

从保藏培养基A上取一环绿色木霉，接入100mL种子培养基A中，置于30℃、150r/min的恒温振荡器培养36h。从保藏培养基B上取一环酿酒酵母，接入100mL种子培养基B中，置于25℃、150 r/min的恒温振荡器内培养24 h。培养后的绿色木霉、酿酒酵母液体种子培养基用于转化乙醇实验。

1.3.4菌株的培养条件对降解稻草转化乙醇的影响

将绿色木霉和酿酒酵母接入100 mL含有稻草和污泥（经121℃灭菌30 min处理）的降解培养基中，在转速为110r/min的气浴恒温振荡器中培养一定时间后，6000r/min离心样品5 min，取上清液用于测定乙醇含量。以乙醇含量为评价指标，考察降解培养基的初始pH值、接种量、降解温度、降解时间、稻草和污泥的质量比（g∶g）及预处理方法对乙醇含量的影响。

1.3.5乙醇含量的测定方法

采用重铬酸钾比色法测定乙醇含量［15-16］。

2　结果与分析

2.1降解培养基初始pH值对乙醇含量的影响

接入1%绿色木霉和1%酿酒酵母种子液于降解培养基中，同时在降解培养基中加入预处理稻草和预处理污泥质量比为1∶5（g∶g），分别调节初始pH值为5、6、7、8、9，然后置于37℃、转速为110 r/min的气浴恒温振荡器中降解48 h后取样，乙醇含量检测结果如图1所示。

由图1可知，当初始pH值在5～7时，乙醇含量随着初始pH值的增高而增加；当初始pH值在7～9时，乙醇含量先随着初始pH值的增高而减少，然后随着pH值的增高略有增高；当发酵培养基初始pH值为7时，乙醇含量最高为24.37 mg/L。由于在pH值为7时，绿色木霉和酿酒酵母大量繁殖，绿色木霉产的纤维素酶活性最大，能使稻草中更多的纤维素降解生成葡萄糖，而此时酿酒酵母将更多的葡萄糖转化为乙醇，从而使乙醇产量增加。因此，选定最适初始pH值为7。

图1　初始pH值对乙醇含量的影响Fig.1 Effect of initial pH on ethanol concentration

2.2菌种接种量对乙醇含量的影响

向初始pH值为7的降解培养基中，加入预处理稻草和预处理污泥质量比为1∶5（g∶g），同时接入绿色木霉和酿酒酵母种子液的接种量百分比为1∶1、2∶1、3∶1、3∶2和4∶3，然后置于37℃、转速为110 r/min的气浴恒温振荡器中降解48 h后取样，乙醇含量检测结果如图2所示。

图2　接种量比对乙醇含量的影响Fig.2 Effect of inoculum ratio on ethanol concentration

由图2可知，当酿酒酵母的接种量为1%、绿色木霉的接种量为1%～3%时，乙醇含量随着绿色木霉的接种量的增加而增加；当绿色木霉的接种量为3%、酿酒酵母的接种量为1%～2%时，随着酿酒酵母的接种量的增加，乙醇含量略有增加；当绿色木霉的接种量为4%、酿酒酵母的接种量为3%时，可得到最高的乙醇含量为49.08mg/L。因此，选定绿色木霉的最适接种量为4%、酿酒酵母的最适接种量为3%。

2.3稻草和污泥质量比对乙醇含量的影响

向初始pH值为7的降解培养基中接入4%绿色木霉和3%酿酒酵母种子液，同时加入预处理稻草和预处理污泥质量比为1∶1、1∶10、1∶5、2∶5和3∶5（g∶g），然后置于37℃、转速为110 r/min的气浴恒温振荡器中降解48 h后取样，乙醇含量检测结果如图3所示。

图3　稻草与污泥质量比对乙醇含量的影响Fig.3 Effect of rice straw and sludge mass ratio on ethanol concentration

由图3可知，当预处理污泥质量为5 g、预处理稻草质量分别为1 g、2 g和3 g时，稻草与污泥质量比为1∶5（g∶g）得到的乙醇含量最高，为49.08 mg/L；稻草与污泥质量比为3∶5（g∶g）得到的乙醇含量次之，为36.71 mg/L；稻草与污泥质量比为2∶5（g∶g）得到的乙醇含量最低，为27.46 mg/L。当预处理稻草质量为1 g、预处理污泥质量分别为1 g、5 g和10 g时，稻草与污泥质量比为1∶10（g∶g）得到的乙醇含量最高，为49.25 mg/L；稻草与污泥质量比为1∶5（g∶g）得到的乙醇含量次之，为49.08 mg/L；稻草与污泥质量比为1∶1（g∶g）得到的乙醇含量最低，为34.15 mg/L。因此，选择预处理稻草与预处理污泥最适质量比为1∶10（g∶g）为宜。

2.4稻草和污泥预处理方法对乙醇含量的影响

取1 g未处理稻草和10 g未处理污泥（标记为均未预处理组）、1 g预处理稻草和10 g未处理污泥（标记为稻草预处理组）、1 g未处理稻草和10 g预处理污泥（标记为污泥预处理组）、1 g预处理稻草和10 g预处理污泥（标记为均预处理组），将初始pH值调节为7，同时接入4%绿色木霉和3%酿酒酵母种子液于稻草和污泥中，然后置于37℃、转速为110 r/min的气浴恒温振荡器中降解48 h后取样，乙醇含量检测结果如图4所示。

图4　稻草和污泥预处理方法对乙醇含量的影响Fig.4 Effect of pretreatment methods of rice straw and sludge on ethanol concentration

由图4可知，均预处理组得到的乙醇含量最高，为49.25 mg/L；污泥预处理组得到的乙醇含量次之，为29.58 mg/L；稻草预处理组得到的乙醇含量再次之，为21.37 mg/L；均未预处理组得到的乙醇含量最低，为19.75 mg/L。NaOH处理会引起稻草中纤维素的孔隙率增加、聚合度降低、结晶度下降和木质素的去除，使稻草中纤维素的降解率大大提高［17-18］，从而使乙醇含量增加。而对污泥进行预处理，可以破坏污泥细胞、释放大量的有机物，从而增强污泥中有机物的利用率［19］。因此，选择均预处理组为宜。

2.5降解温度对乙醇含量的影响

向初始pH值为7的降解培养基中，加入预处理稻草和预处理污泥质量比为1∶10（g∶g），同时接入4%绿色木霉和3%酿酒酵母种子液，然后分别置于不同的温度、转速为110 r/min的气浴恒温振荡器中降解48 h后取样，乙醇含量检测结果如图5所示。

图5　降解温度对乙醇含量的影响Fig.5 Effect of degradation temperature on ethanol concentration

由图5可知，当降解温度在27～37℃时，乙醇含量随着发酵温度的升高而增加；降解温度为37℃时，乙醇含量最高，为49.25 mg/L；当降解温度在37～47℃时，乙醇含量随着发酵温度的升高而降低，可能是由于温度较高，绿色木霉产的纤维素酶活性不高，致使糖化速率降低，从而限制了降解过程。ANDERSON P J等［20］研究结果表明，当温度＞43℃时，酵母的活性有所降低，因此，高温可能降低酵母的菌体活性以及菌体对乙醇的耐受程度。LARKN等［21］利用马克斯克鲁维酵母（Kluveromyces marxianus）同步糖化发酵造纸污泥时，发现最适温度为38℃，高于或低于38℃都将导致乙醇发酵效率降低。江丹等［22］利用利用商业纤维素酶和酒精酵母SHY08-3同步糖化发酵脱墨废纸污泥和化学制浆污泥产乙醇，研究结果表明，在37℃条件下脱墨废纸污泥和化学制浆污泥均可获得最大乙醇发酵速率。因此，选定最适降解温度为37℃。

2.6降解时间对乙醇含量的影响

向初始pH值为7的降解培养基中，加入预处理稻草和预处理污泥质量比为1∶10（g∶g），同时接入4%绿色木霉和3%酿酒酵母种子液，然后置于37℃、转速为110 r/min的气浴恒温振荡器中降解12 h、24 h、36 h、48 h和60 h后取样，乙醇含量检测结果如图6所示。

图6　降解时间对乙醇含量的影响Fig.6 Effect of degradation time on ethanol concentration

由图6可知，当降解时间在0～12 h时，乙醇含量增加迅速，表明绿色木霉和酿酒酵母能较快的将稻草转化为乙醇；当降解时间在12～24 h时，乙醇含量减少，说明绿色木霉将稻草中的纤维素转化为葡萄糖的速度较酿酒酵母将葡萄糖转化为乙醇的速度快，所以葡萄糖对绿色木霉产的纤维素酶活性存在反馈抑制，导致乙醇含量减少；当降解时间在24～48 h时，乙醇含量迅速增加，表明葡萄糖对绿色木霉产的纤维素酶活性的反馈抑制消除；当降解时间在48～60 h时，乙醇产量较少，表明绿色木霉和酿酒酵母进入衰亡期，从而使乙醇含量减少。当降解时间为48 h时，乙醇含量最高，为49.25 mg/L。因此，选定降解时间为48 h为宜。

3　结论

本研究选用绿色木霉和酿酒酵母降解稻草转化为乙醇，并利用污泥作为该过程中绿色木霉和酿酒酵母生长所需的氮源，对该过程中影响乙醇产量的因素进行优化。优化后的降解条件：降解培养基中预处理稻草和预处理污泥质量比为1∶10（g∶g），培养基初始pH值为7，绿色木霉和酿酒酵母的接种量分别为4%和3%，降解温度为37℃，在此条件下降解48 h，可得到最高的乙醇含量为49.25 mg/L。

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Degradation of rice straw to ethanol usingTrichoderma virideandSaccharomyces cerevisiae

LÜ Jiliang，CHEN Aoyu，WANG Zhen
（School of Environmental Science and Engineering，Hubei Polytechnic University，Huangshi 435003，China）

Rice straw and sludge were used as carbon source and nitrogen source respectively，rice straw were degraded to ethanol byTrichoderma virideandSaccharomyces cerevisiae.The factors affecting ethanol yield in degradation were optimized.The results showed that the highest ethanol concentration was 49.25 mg/L，under the conditions of the pretreated rice straw and sludge mass ratio 1∶10（g∶g），initial pH of degradation medium 7，T.virideandS.cerevisiaeinoculum 4%and 3%，degradation temperature 37℃and time 48 h.

rice straw；sludge；Trichoderma viride；Saccharomyces cerevisiae；ethanol

X705

A

0254-5071（2015）11-0079-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.018

2015-09-07

湖北省教育厅科学技术研究指导性项目（B2014030）

吕继良（1982-），男，讲师，博士，研究方向为生物质能源转化。