米醋废渣发酵红曲色素的条件研究

米醋废渣发酵红曲色素的条件研究

杜甫军1，胡伟莲2，冯纬1，戴德慧2
（1.杭州食品酿造有限公司，浙江杭州310017；2.浙江科技学院，浙江杭州310023）

对米醋废渣主要成分进行了分析，其中干燥质量损失为66.89%，酒精度为4.15%vol，干物质中粗蛋白、粗淀粉、粗纤维、粗脂肪含量分别为63.83%、7.55%、10.77%、9.02%。以米醋废渣为发酵培养基对8株红曲霉进行了筛选，得到一株红曲色素产量较高的红曲霉MS-5，其色素合成周期显著短于同条件下的大米培养基。通过单因素及正交试验对米醋废渣红曲色素发酵工艺进行了优化，结果表明，最佳工艺参数为葡萄糖添加量5%，氯化铵添加量1.5%，初始水含量50%，初始pH值6.0，发酵时间6 d。在此条件下红曲色素发酵产量可达（1 252.5±47）U/g。

米醋废渣；红曲色素；固态发酵；优化

红曲色素是由红曲霉属（Monascus）的丝状真菌在生长代谢过程中合成的次级代谢产物，与其他天然色素相比，具有安全性高、色泽鲜红、着色力强、稳定性好、口味自然及pH适用范围广等优点［1-2］。此外，研究还发现红曲色素具有降低血脂、降血压、防腐保鲜等生理活性。因此红曲色素具有天然、营养、多功能等多重特点［3-4］，现已广泛应用于食品、医药及化工等行业中。

目前红曲色素的生产方法主要有固态和液态发酵两种。液态发酵虽然自动化程度高，生产周期短，但其色素产量较低，耗水量大，发酵后有大量的废水需要处理。而固态发酵具有生产节水、提取成本低、操作简单、不会造成二次污染等优点［5］，因此，红曲色素的工业化生产仍以大米为原料进行固态发酵生产为主。但由于耗粮高，不利于红曲色素产业的发展。在现代大型米醋酿造企业，其排放的米醋废渣是大米经过糖化、酒精发酵后，醋酸发酵前发酵液压榨后排放的残渣，有大量可利用营养成分。目前，大部分残渣只是简单的干燥后被当作廉价的饲料出售，经济效益不太明显。利用食醋废渣发酵生产红曲色素少见文献报道。本研究对米醋废渣替代大米生产红曲色素进行了初步探讨，为米醋废渣再生利用，降低红曲色素生产成本开辟新的途径。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

红曲霉MS-1、MS-2、MS-3、MS-4、MS-5、MS-6、MS-7、MS-8：由杭州食品酿造有限公司研发中心收集并保藏。

新鲜米醋废渣：杭州食品酿造有限公司。

斜面培养基：麦芽浸粉2.0%，蛋白胨0.5%，琼脂2.0%，pH自然。

液体种子培养基：麦芽浸粉2.0%，蛋白胨0.5%，pH自然。

米醋废渣培养基：米醋废渣取30 g装入300 mL三角瓶内，八层纱布封口，121℃灭菌30 min。

传统大米培养基：大米30 g，pH 4.0的乳酸水浸泡20 h后沥干水分，含水量50%左右，装入300 mL三角瓶中，八层纱布封口，121℃灭菌30 min。

1.2仪器与设备

BS224S型电子天平：北京赛多利斯系统有限公司；BL-50A型高压蒸汽灭菌锅、MJX-250B-Z型霉菌培养箱、GZX-9140MBE型电热恒温鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1B型净化工作台：苏州净化设备有限公司；UV5100分光光度计：上海元析仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1米醋废渣中主要成分分析

对深层液态发酵米醋新鲜废渣连续采样3批，对其干燥质量损失、粗蛋白、粗淀粉、酒精度、粗纤维素含量等理化指标进行测定分析。

1.3.2菌种活化

取活化后的斜面菌种一支，用无菌水将孢子洗下。接种于液体种子培养基中，30℃培养4 d后，按接种量的5%接入米醋废渣培养基中。

1.3.3红曲色素合成菌株筛选

将收集的8株红曲霉分别制成液体种子后接入米醋废渣固体培养基中，32℃培养6 d，测定红曲色素含量，比较各菌株色素合成能力，选出色素合成能力最强的菌株进行后续试验。

1.3.4培养时间对红曲色素合成的影响

将红曲霉MS-5的液体种子分别接入传统大米培养基及米醋废渣培养基中，32℃培养9 d，每隔24 h测定一次红曲色素含量。

1.3.5单因素及正交试验

以米醋废渣发酵培养基为基础，考察了不同种类及含量的碳源、氮源、初始水分含量、初始pH值等培养基条件对红曲色素的合成影响。并在此基础上，选择葡萄糖添加量、氯化铵添加量、初始水分含量、初始pH值4个因素，进行4因素3水平正交试验优化。

1.3.6测定方法

粗蛋白的测定：GB 50095—2010《食品中蛋白质的测定》［6］；粗脂肪的测定：GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的测定》［7］；干燥质量损失参照含水量的测定：GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》［8］；粗纤维的测定：GB/T5009.10—2003《植物类食品中粗纤维的测定》［9］；粗淀粉的测定：GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的测定》［10］；红曲色素的测定：GB 4926—2008《食品添加剂红曲米（粉）》［11］；酒精度的测定参照文献［12］。

2　结果与分析

2.1米醋废渣中主要成分分析

对新鲜米醋废渣中的干燥质量损失、粗纤维、粗脂肪、粗蛋白、粗淀粉、酒精等理化进行了测定，其结果见表1。

表1　米醋废渣中主要成分及含量Table 1 Main components and contents of vinegar wastes

现代制醋企业为了适应大型自吸式发酵罐的溶氧需要，酒精发酵后即压滤排出废渣，清液进行醋酸发酵。从表1米醋废渣的理化分析可以看出，大米经过糖化、酒精发酵后废渣中粗淀粉的含量较少。而大米中蛋白质未被利用，残留在废渣中，同时酒精发酵后大量酵母细胞残留。红曲霉中含有较高酶活力的淀粉酶和蛋白，同时能耐受较高的酒精度。因此，米醋废渣可以作红曲霉的培养基质，发酵生产红曲色素具有一定的可行性。

2.2红曲色素合成菌株筛选

将试验室保藏的8株菌株进行了产红曲色素能力的筛选，其结果见图1。

图1　不同红曲霉菌株红曲色素的产量Fig.1 Monascus pigments production of different strains

由图1所示，在米醋废渣培养基中，不同菌株产红曲色素的能力各不相同，其中MS-5菌株色素合成能力最高，在米渣培养基中生长良好，色素合成均匀。因此，以MS-5为发酵菌株进行下一步研究。

2.3培养时间对红曲色素产量的影响

以传统的大米培养基为对照，考察了培养时间对红曲霉MS-5对红曲色素合成的影响，结果见图2。

由图2可知，在大米培养基中红曲色素最高产量高于米醋废渣培养基，但在米醋废渣培养基中色素合成速度较快，培养2～3 d颜色就有明显变化，6 d红曲色素产量达到最高，在大米培养基中，8 d才达到高峰。这可能与两者培养基中碳氮比差异较大有关，大米培养基中淀粉含量较高，碳氮比高，有利于菌体生长，推迟了次生代谢产物红曲色素的合成。因此，米醋废渣培养基合成红曲色素的周期较大米培养基短。

图2　培养时间对红曲色素产量的影响Fig.2 Effect of culture time on Monascus pigments production

2.4碳源种类及添加量对红曲色素产量的影响

米醋废渣经过糖化、酒精发酵、压榨去清液后，碳源含量相对较低［13］，为了提高红曲色素的产量，在米醋废渣培养基中添加不同含量的葡萄糖、蔗糖、淀粉等常用碳源，接种红曲霉进行固态培养，32℃培养6 d后，测定红曲色素产量，结果见图3。

图3　碳源种类及添加量对红曲色素产量的影响Fig.3 Effect of carbon sources type and addition on Monascus pigments production

由图3可知，在米醋废渣培养基中添加部分碳源，能明显提高红曲色素的产量，且碳源种类对红曲色素合成也有较大的差异，葡萄糖为添加碳源时明显优于淀粉与蔗糖。其添加比例为4%时红曲色素产量最高。因此，选择葡萄糖添加量4%为宜。

2.5氮源种类及添加量对红曲色素产量的影响

氮源是微生物菌体成分及红曲色素的重要组成部分，米醋废渣中虽含量大量的大米蛋白，但属于迟效氮源，需要在蛋白酶的作用下水解为氨基酸后才能被菌体利用。由于红曲霉蛋白酶合成较少且刚接种时菌丝体量少，淀粉酶活力偏低，可能会影响红曲霉生长及色素合成。考察了添加外源速效氮源对红曲色素合成的影响，在米醋废渣培养基中添加了不同含量的蛋白胨、氯化铵、尿素进行固态发酵，其结果见图4。

图4　氮源种类及添加量对红曲色素产量的影响Fig.4 Effect of nitrogen source types and addition on Monascus pigments production

由图4可知，不同外加氮源的种类及含量对红曲色素合成影响较大，添加有机氮源蛋白胨，对红曲色素的合成有一定的促进作用，但差异不大。添加有机氮源尿素对红曲色素的合成有一定的抑制作用。可能是红曲霉对尿素耐受性低，其菌丝的生长受到了明显的影响。添加无机氮源氯化铵能有效提高红曲色素的产量，最佳添加量为1.5%。这可能是氯化铵能快速的被红曲霉利用，促进了菌体的生长，为次生代谢产物红曲色素的合成提供了充足的前体，从而有利于红曲色素的合成。这与文献报道一致［14］。2.6基质初始含水分含量对红曲色素产量的影响

基质初始含水量分别控制在30%、40%、50%、60%、70%，接种红曲霉进行固态培养，培养6 d后，测定红曲色素含量，其结果见图5。

图5　初始水分含量对红曲色素产量的影响Fig.5 Effect of original moisture content on Monascus pigments production

由图5可知，随着基质初始水分含量增加，红曲色素含量不断增加，但初始水分含量＞50%以后，红曲色素的含量开始显著下降。这可能是因为初始水分含量过低其培养基膨胀程度低，同时培养过程中水分蒸发造成基质物料干燥，从而影响红曲霉的生长及红曲色素合成。但水分含量过高，基质易黏结且有黏液产生，降低了基质多孔性，减少了基质内气体的体积和气体交换，不利于通风降温，影响了红曲霉的生长及色素的合成［15］。因此，选择初始水分含量为50%。

2.7基质初始pH值对红曲色素产量的影响

红曲霉在偏酸性环境下生长较好，较高的pH值条件下在培养过程较易染菌。因此，考察了基质初始pH在3～7范围内对红曲色素合成的影响，其结果见图6。

图6　初始pH对红曲色素产量的影响Fig.6 Effect of original pH on Monascus pigments production

由图6可知，红曲霉在初始pH 3～7范围内均能生长并产生红曲色素，初始pH＜6.0时，红曲色素产量随着pH增加而增加，但pH＞6.0后红曲色素的产量发生明显的下降。因此，过高和过低的pH均不利于红曲色素的合成，最佳的初始pH值选择为6.0。

2.8正交试验优化培养基条件对红曲色素合成的影响

在单因素试验的基础上，选择葡萄糖添加量、氯化铵添加量、初始水分含量、初始pH值为4个因素，每个因素选择3个水平，以红曲色素产量为考察指标，进行4因素3水平正交试验。

表2　培养条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for culture conditions optimization

由表2可知，对红曲色素合成影响因素大小依次为葡萄糖添加量＞初始水分含量＞初始pH值＞氯化铵添加量。这反映出葡萄糖的添加量及初始水分含量是影响红曲色素合成的重要条件，在基质中适当的添加葡萄糖及维持合适的水分含量可以大幅度提高红曲色素的合成。综合以上分析，最佳培养条件为葡萄糖添加量为5%，氯化铵添加量为1.5%，初始水分含量为50%，初始pH值为6.0。在该条件下进行验证试验。其红曲色素产量可达（1 252.5±47）U/g。表明通过正交优化能显著提高红曲色素的合成。

3　结论

利用米醋废渣替代大米固态发酵红曲色素具有一定的可行性，收集红曲霉中MS-5菌株在米醋废渣培养基中表现较高的色素合成能力，色素合成周期短于大米培养基。

通过一系列单因素试验及正交试验优化了米醋废渣红曲色素发酵工艺，最佳工艺为葡萄糖添加量5%，氯化铵添加量1.5%，初始水分含量50%，初始pH值6，发酵时间6 d。此条件下红曲色素产量可达（1 252.5±47）U/g。

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［6］中华人民共和国卫生部.GB 50095—2010食品中蛋白质的测定［S］.北京：中国标准出版社，2010.

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［8］中华人民共和国卫生部.GB 5009.3—2010食品中水分的测定［S］.北京：中国标准出版社，2010.

［9］中华人民共和国卫生部.GB/T 5009.10—2003植物类食品中粗纤维的测定［S］.北京：中国标准出版社，2003.

［10］中华人民共和国卫生部.GB/T 5009.9—2008食品中淀粉的测定［S］.北京：中国标准出版社，2008.

［11］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB 4926—2008食品添加剂红曲米（粉）［S］.北京：中国标准出版社，2008.

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［15］刘颖.红曲色素的固态发酵法制取技术及其稳定性研究［D］.长沙：湖南农业大学硕士论文，2006.

Fermentation conditions of Monascus pigments with vinegar wastes

DU Fujun1，HU Weilian2，FENG Wei1，DAI Dehui2
（1.Hangzhou Food Brewing Co.，Ltd.，Hangzhou 310017，China；2.Zhejiang University of Science and Technology，Hangzhou 310023，China）

The main components of vinegar wastes were analyzed.The results showed that loss on drying，alcohol content，crude protein，crude starch，crude fiber，crude fat were 66.89%，4.15%vol，63.83%，7.55%，10.77%and 9.02%，respectively.Using vinegar wastes as fermentation medium，a strain namedMonascussp.MS-5 with high-yield Monascus pigments was screened from eight strains，and the pigments synthesizing cycle reduced significantlycompared with the rice medium in the same condition.The optimal fermentation conditions of vinegar waste Monascus pigments were optimized by single factor and orthogonal experiments.Results indicated that the optimal technology parameters were glucose 5%，ammonium chloride 1.5%，original moisture content 50%，original pH 6.0 and fermentation time 6 d.The yield of Monascus pigments reached up to（1 252.5±47）U/g at the optimal condition.

vinegar wastes；Monascus pigments；solid state fermentation；optimization

Q93-331

A

0254-5071（2015）11-0071-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.016

2015-10-11

浙江省科技计划项目（2014C33039）

杜甫军（1968-），男，工程师，本科，主要从事酿造行业的科研与生产工作。