碱性蛋白酶酶解缢蛏制备多肽工艺

张惠婷，程文健，赵卉双，钟 机，陈丽娇

(福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002)

缢蛏是软体动物门竹蛏科水产动物[1]。在我国沿海地区，尤其在气候比较温暖的福建、浙江和广东等地缢蛏产量较高[2]。缢蛏富含蛋白质以及钙、磷、铁、碘等矿物质，热量、脂肪含量较低[3]，是一种食用价值极高的高蛋白低脂肪水产动物。蛋白质是人体内不可缺少的重要营养物质[4]。但蛋白质相对分子质量较大且结构复杂，不易被人体消化吸收[5]。因此，如何提高蛋白质的消化利用率，成为当前研究热点。将蛋白质水解成小分子的生物活性多肽，是提高蛋白质消化利用率的有效方法之一，且已有研究表明，二肽以上的多肽能被人体完整吸收[6]。

生物活性多肽是指具有特定氨基酸序列的生物活性物质[7]，不但能提供生长发育所需的营养物质，还具有免疫调节、抗高血压、抗病毒、抗细菌等多种生理活性[8]。生物活性多肽的制备方法以酶解法应用最广泛[9]。由于酶水解具有较高的选择性[10]，且受pH、料液比、酶解温度、酶添加量、酶解时间等因素的影响，因此，利用酶解法制备多肽时，酶的选择及酶解条件的控制尤为重要。碱性蛋白酶是来源于枯草杆菌的一种内切酶，能水解含谷氨酸(Glu)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)、赖氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)的肽键[11]，水解位点较多。利用碱性蛋白酶对蛋白质进行水解，生物活性肽得率高。因此，本研究采用碱性蛋白酶对缢蛏进行水解，并在单因素试验基础上采用正交试验优化酶解工艺，为酶解法制备缢蛏多肽提供依据。

1 材料与方法

1.1 原料与设备

1.1.1 原料 缢蛏购于福州市永辉超市;碱性蛋白酶购于北京索莱宝科技有限公司，酶活性为203 000 U·g－1;Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准品购于Sigma公司。

1.1.2 设备 BS 224S型电子分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司];T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);TGL-16C型台式离心机(上海安亭科学仪器厂);PB-10型pH计[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]。

1.2 试验方法

1.2.1 酶解流程 缢蛏—→绞碎—→酶解—→灭酶—→粗提液—→离心—→取上清液—→测定多肽含量。

1.2.2 主要成分的测定 (1)水分:采用直接干燥法[12];(2)蛋白质:采用凯氏定氮法[13]。(3)粗脂肪:采用索氏提取法[14]。

1.2.3 多肽含量的测定 凡具有2个直接连接的肽键都有双缩脲反应[15]。因此，参照文献[16－17]多肽含量的测定方法，获得四肽标准品的质量浓度[X/(mg·mL－1)]与其光密度(Y)之间的回归方程为:Y=0.144 3X+0.001 7，R2=0.999 8，X∈(0，1)。

称取10 g缢蛏，在特定酶解工艺参数下水解后，90℃水浴中灭酶10 min，冷却后将水解产物在8 000 r·min－1离心15 min，取上清液A。量取上清液A以及等体积三氯乙酸水溶液(0.1 g·mL－1)，混匀、静置10 min后，4 000 r·min－1离心15 min，取上清液B。将上清液B与双缩脲试剂按3∶2的体积比加入试管中反应10 min后，2 000 r·min－1离心10 min，取上清液测定D540nm，再根据所得的标准四肽回归方程，计算上清液B中多肽含量。

式中，M为缢蛏多肽含量/(mg·g－1);“2”表示相同体积的上清液A与10%三氯乙酸混合后反应体系体积扩大的倍数;C为上清液B多肽含量/(mg·mL－1);V为上清液A的总体积/mL;m为缢蛏质量/g。

1.2.4 试验方案 (1)单因素试验:准确称取10 g缢蛏，酶解，固定其他因素，分别考察pH值(8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)、料液比(1∶1.0、1∶2.0、1∶3.0、1∶4.0、1∶5.0、1∶6.0)、温度(30、40、50、60、70 ℃)、酶添加量(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%)和酶解时间(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h)对缢蛏多肽含量的影响。按1.2.3方法测定缢蛏多肽含量，每组重复3次，取平均值。

(2)正交试验:采用L25(56)正交试验设计优化碱性蛋白酶的酶解工艺。试验因素及水平见表1。

表1 碱性蛋白酶正交试验因素及水平Table1 Factors and levels of the orthogonal experiment for alkaline protease

2 结果与分析

2.1 缢蛏主要成分分析

测定表明，缢蛏水分含量为80.74%、蛋白质含量为15.51%、粗脂肪含量为2.35%，其余成分含量仅占1.40%。由此可见，除水分外鲜缢蛏中蛋白质含量最高，适合作为制备生物多肽的原料。

2.2 pH值对碱性蛋白酶酶解效果的影响

由图1可知，反应液pH值在8.0－11.0之间时，多肽含量呈缓慢的先上升后下降趋势，当pH值为9.0时，达到最高水平;当pH值＞11.0时，可能由于反应液碱性过高导致碱性蛋白酶活性降低，多肽含量也开始明显下降。因此，采用碱性蛋白酶酶解缢蛏的较佳pH值为9.0左右。

图1 pH值对碱性蛋白酶酶解效果的影响Fig.1 Effects of hydrolytic pH on the yield of peptides

2.3 料液比对碱性蛋白酶酶解效果的影响

由图2可知，料液比在1∶1.0至1∶2.0之间时，由于反应体系中溶液少，碱性蛋白酶扩散速度较慢，导致酶与底物接触的机会也较少，多肽含量上升趋势缓慢。而当料液比在1∶2.0至1∶3.0之间时，多肽含量上升趋势较快，料液比为1∶3.0时达到最高水平。之后可能由于反应体系中溶液增多，降低了底物与酶分子结合的机会，多肽含量开始下降。综合来看，料液比选取1∶3.0左右为宜。

图2 料液比对碱性蛋白酶酶解效果的影响Fig.2 Effects of hydrolytic solid-liquid ratio on the yield of peptides

2.4 酶解温度对碱性蛋白酶酶解效果的影响

由图3可知，酶解温度在30－50℃之间时，碱性蛋白酶酶解效果较稳定。当温度达到40℃时，多肽含量最高。当温度＞50℃时，温度过高导致部分碱性蛋白酶失活，且使绝大部分缢蛏蛋白发生变性，导致多肽含量急剧下降。因此，酶解温度选择40℃左右较佳。

图3 酶解温度对碱性蛋白酶酶解效果的影响Fig.3 Effects of hydrolytic temperature on the yield of peptides

2.5 酶添加量对碱性蛋白酶酶解效果的影响

由图4可知，当酶添加量在1.0% －2.0%之间时，多肽含量呈上升趋势。而当酶添加量在2.0% －3.0%之间时，由于反应体系中酶量相对较充足，除将缢蛏蛋白进行水解外，还将酶解过程中产生的大分子多肽水解成小分子肽或氨基酸，降低多肽含量。当酶添加量＞3.0%时，由于反应体系中缢蛏蛋白已经较完全水解，且水解液中的肽段切点已不适合碱性蛋白酶，多肽含量无明显变化。因此，酶添加量应控制在2.0%左右。

图4 酶添加量对碱性蛋白酶酶解效果的影响Fig.4 Effects of hydrolytic enzyme added on the yield of peptides

2.6 酶解时间对碱性蛋白酶酶解效果的影响

由图5可知，在酶解前期，多肽含量随酶解时间延长呈上升趋势，在2.0 h时，多肽含量最高，达到78.5 mg·g－1。而＞2.0 h时，由于水解液中有限数量的碱性蛋白酶除将缢蛏蛋白进行水解外，还将水解过程中产生的大分子多肽水解成更小分子的肽或氨基酸，从而降低了多肽含量。因此，酶解时间控制在2.0 h效果较佳。

图5 酶解时间对碱性蛋白酶酶解效果的影响Fig.5 Effects of hydrolytic time on the yield of peptides

2.7 正交试验设计优化结果

正交试验优化酶解工艺结果见表2。对表2中极差R值进行比较可知，5个因素对多肽含量影响程度依次为:酶添加量＞料液比＞时间＞温度＞pH值。由表2中K值可知，最优水平为:pH=9.5、酶添加量1.5%、料液比1∶3.0、温度45 ℃、时间2.5 h。

表2 碱性蛋白酶正交试验结果Table2 Results of orthogonal experiment in alkaline protease

应用DPS数据处理系统进行方差分析，结果见表3。由表3可知，5个因素对多肽含量影响顺序为:酶添加量＞料液比＞时间＞温度＞pH值，与极差分析结果相一致。酶添加量F值极显著，说明碱性蛋白酶酶添加量在1.0% －3.0%之间，对多肽含量有极显著影响，这与图4变化趋势相一致;料液比、时间F值显著，说明在碱性蛋白酶酶解工艺中料液比、酶解时间对多肽含量有显著影响，这与图2、图5变化趋势相符;pH值、温度F值不显著，说明pH值、温度对多肽含量影响都不显著。根据表2、表3的结果，选择pH 值为9.5、酶添加量1.5%、料液比1∶3.0、温度45 ℃、时间2.5 h为最佳组合。

表3 碱性蛋白酶正交试验方差分析Table3 Variance analysis of orthogonal experiment for alkaline protease

将正交试验所得最优组合进行3次验证试验，结果显示最优组合下多肽含量达(81.3±0.4)mg·g－1，表明碱性蛋白酶酶解工艺参数优化成功。

3 结论

利用碱性蛋白酶酶解缢蛏蛋白，在单因素试验基础上，采用正交试验优化缢蛏多肽的制备工艺条件，以期得到缢蛏多肽制备的最适酶解环境。结果表明最适条件为:pH值9.5、酶添加量1.5%、料液比1∶3.0、酶解温度45℃、酶解时间2.5 h，在此工艺条件下每克鲜缢蛏可提取多肽(81.3±0.4)mg。

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