藤茶主要成分对胰岛素抵抗HepG2细胞内氧化应激水平的影响△

潘慧敏，姜保平，乐亮，肖伟，许利嘉*，肖培根

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 北京 100193； 2.国家教育部中草药物质基础与资源利用重点实验室 北京 100193)

·健康产业·

藤茶主要成分对胰岛素抵抗HepG2细胞内氧化应激水平的影响△

潘慧敏1，2，姜保平1，2，乐亮1，肖伟1，2，许利嘉1，2*，肖培根1，2

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 北京 100193； 2.国家教育部中草药物质基础与资源利用重点实验室 北京 100193)

目的：探讨藤茶主要成分，二氢杨梅素、没食子酸、二氢槲皮素、杨梅素及杨梅苷对胰岛素抵抗HepG2细胞糖消耗及细胞内活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、乳酸(LD)、三磷酸腺苷(ATP)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性的影响。方法：将HepG2细胞分为正常对照组、胰岛素抵抗模型组和样品干预组。用高糖(55 mmol·L-1)诱导HepG2细胞，建立胰岛素抵抗模型，用MTT法检测样品对HepG2细胞增殖的影响；用葡萄糖氧化酶法检测上清中葡萄糖的含量；用分光光度法检测细胞内MDA、LD含量及SOD、CAT活性；用荧光酶标仪检测细胞内ROS和ATP水平。结果：五个化合物在有效浓度范围内对HepG2细胞增殖无显著影响；样品干预组葡萄糖消耗量较模型组显著升高；与模型组相比，五个化合物某个或某几个浓度组显著降低细胞内MDA含量，提高SOD、CAT活性及ATP水平；没食子酸、二氢槲皮素和杨梅苷显著降低细胞内ROS水平；除二氢杨梅素外，其余四个化合物均能降低细胞内LD含量。结论：胰岛素抵抗HepG2细胞与对照组细胞相比有较高的氧化应激水平，抗氧化能力减弱。藤茶主要成分能通过降低细胞的氧化应激水平，增加细胞的抗氧化能力，从而预防胰岛素抵抗。

藤茶；HepG2细胞；胰岛素抵抗；氧化应激

胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)是指机体对一定量胰岛素的生物学反应低于预计正常水平的一种现象，也就是机体对胰岛素的反应减退。胰岛素抵抗被认为是糖尿病、肥胖、脂代谢紊乱等慢性代谢性疾病的共同的生理病理学基础[1]，因此对于胰岛素抵抗发生机制的研究具有非常重要的意义。

多种致病因素如高血糖、高游离脂肪酸血症以及促炎因子分泌增加均可导致胰岛素抵抗。研究表明，上述因素导致胰岛素敏感性下降的共同机制之一是促进机体的氧化应激[2-3]。氧化应激是指机体内活性氧(ROS)的生成增加和(或)清除能力降低，导致ROS的生成和清除失衡。ROS具有重要的生理作用，但过量则引起分子、细胞和机体的损伤[4-5]，导致细胞内MDA、LD含量升高，SOD、CAT活性下降[6]，ATP水平降低[7]。大量研究表明，胰岛素抵抗的发生与机体的氧化应激状态有着密不可分的关系，过多的氧自由基促发胰岛素抵抗，而胰岛素抵抗又反过来加重氧化应激[8]。机体氧化应激水平越高，抗氧化防御能力越弱，胰岛素抵抗的程度就越高。因此，降低高血糖细胞的氧化应激水平，是改善细胞胰岛素抵抗的途径之一。

藤茶，系葡萄科蛇葡萄属植物显齿蛇葡萄Ampelosisgrossedentata(Hand.-Mazz)W.T.Wang的嫩茎叶[9]，是中国民间流传已久的古茶。文献报道，藤茶具有显著的抗氧化活性[10]。前期研究发现，藤茶具有显著的预防胰岛素抵抗的活性。藤茶总黄酮及二氢杨梅素能够明显降低高脂饮食大鼠的血脂水平，对多种动物模型有明显的降低血糖的作用，而对正常小鼠血糖无明显影响[11-12]。然而，藤茶是否能通过改善氧化应激水平而预防胰岛素抵抗，这方面的研究至今尚无报道。

二氢杨梅素、没食子酸、二氢槲皮素、杨梅素及杨梅苷为藤茶中的主要成分，其中以二氢杨梅素含量最高。本实验首次研究了藤茶主要成分对胰岛素抵抗HepG2细胞糖消耗、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、乳酸(lactic acid，LD)、三磷酸腺苷(adenosine 5’-triphosphate，ATP)的影响，探讨藤茶预防胰岛素抵抗的物质基础及可能的作用机制，为藤茶的深度开发，资源进一步的充分利用，提供理论依据。

1 实验材料

1.1 仪器

DL-CJ-IND-Ⅱ超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；3100型CO2细胞培养箱：美国Thermo Forma公司；CKX41倒置显微镜：日本Olympus公司；Fluoroskan Ascent FL型荧光/化学发光分析仪：美国Thermo Forma公司；MQX200型酶标仪：美国BioTek公司；

1.2 试剂

DMEM低糖培养基：HyClone公司；胎牛血清：美国Gibco公司；青-链霉素：HyClone公司；0.25%胰蛋白酶：美国Gibco公司；二甲基亚砜(DMSO)：国药集团化学试剂有限公司；四氮甲唑蓝(MTT)：美国Sigma公司；牛胰岛素：美国Sigma公司；葡萄糖测定试剂盒：北京普利莱基因技术有限公司；超氧化物歧化酶检测试剂盒：日本同仁化学研究所；乳酸测试盒：南京建成生物工程研究所；活性氧检测试剂盒、脂质氧化检测试剂盒、过氧化氢检测试剂盒、ATP检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒：碧云天生物技术研究所。其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 材料

HepG2细胞株：中国医学科学院基础研究所；二氢杨梅素、没食子酸、二氢槲皮素、杨梅素、杨梅苷购自上海融禾医药科技发展有限公司。

2 方法

2.1 HepG2胰岛素抵抗细胞模型的建立

根据文献方法[13]加以改进，取对数生长期细胞制成细胞悬液，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基稀释，以105个/孔的细胞密度接种于96孔细胞培养板，100 μL/孔，于37 ℃，5% CO2的恒温培养箱中培养。当细胞贴壁后，弃去上清液，加入新鲜配制的不同浓度的高糖溶液100 μL/孔继续于37 ℃，5% CO2的恒温培养箱中培养不同的时间，用预热的PBS冲洗2遍后，用1 nmol·L-1胰岛素刺激15 min，葡萄糖测定试剂盒检测细胞培养液上清的葡萄糖含量，计算葡萄糖消耗量。最终选定以55 mmol·L-1的高糖溶液作用24 h建立胰岛素抵抗模型。

2.2 藤茶主要成分对HepG2细胞增殖的影响

取对数生长期细胞，以105个/孔的细胞密度接种于96孔细胞培养板。将细胞分为正常对照组和样品干预组，样品干预组换无血清的含药培养基，样品终剂量分别为二氢杨梅素、没食子酸、二氢槲皮素、杨梅素、杨梅苷：5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、150 μmol·L-1、200 μmol·L-1、300 μmol·L-1及400 μmol·L-1，每个浓度设8个复孔，加药24 h后，移出培养液，将5 mg·mL-1的MTT原液与无血清DMEM培养基按体积比1∶>9配成MTT溶液，每孔加入100 μL，4 h后换二甲基亚砜，震荡10 min，在酶标仪570 nm波长下测定各孔吸光度值。

2.3 藤茶主要成分对胰岛素抵抗HepG2细胞糖消耗的影响

根据文献方法[13]加以改进，取对数生长期细胞，以105个/孔的细胞密度接种于96孔细胞培养板。将细胞分为正常对照组、模型组及样品干预组。样品干预组换无血清的含药培养基，样品终剂量分别为二氢杨梅素、没食子酸、二氢槲皮素、杨梅素、杨梅苷：5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1及40 μmol·L-1，每个浓度设8个复孔，加药24 h后，上述各组(除空白对照组)再分别加高糖(55 mmol·L-1)处理24 h后。各组细胞用预热的PBS冲洗2遍，用1 nmol·L-1胰岛素刺激15 min，用葡萄糖测定试剂盒检测细胞培养液上清的葡萄糖含量，计算葡萄糖消耗量。

2.4 藤茶主要成分生化指标测定

根据文献方法[13]加以改进，取对数生长期细胞，以105个/孔的细胞密度接种于96孔细胞培养板。将细胞分为正常对照组、模型组及样品干预组。样品干预组换无血清的含药培养基，样品终剂量分别为二氢杨梅素、没食子酸、二氢槲皮素、杨梅素、杨梅苷：5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20及40 μmol·L-1，每个浓度设8个复孔，加药24 h后，上述各组(除空白对照组)再分别加高糖(55 mmol·L-1)处理24 h后。收集细胞，按照试剂盒方法处理细胞样品并测定ROS、MDA、SOD、CAT、LD、ATP水平。

2.5 统计分析

结果均以±s形式表示，所有数据采用SPSS17.0统计学软件进行单因素方差分析，组内比较采用Duncan’ s检验，P<0.05有显著性差异。

3 结果

3.1 藤茶主要成分对HepG2细胞增殖的影响

图1 藤茶主要成分对HepG2细胞增殖的影响

图1表明，五个化合物浓度在100 μmol·L-1范围内时，细胞存活率均接近100%，对细胞增殖无显著影响。当样品浓度增大到150 μmol·L-1时，二氢杨梅素、二氢槲皮素、杨梅素才开始对细胞增殖起到抑制作用。

3.2 藤茶主要成分对胰岛素抵抗HepG2细胞糖消耗影响

如表1所示，模型组细胞糖消耗量明显低于正常对照组(P<0.01)，说明建模成功。用藤茶各部位预处理24 h后，再给予高糖刺激，与模型组相比，除杨梅素5 μmol·L-1、10 μmol·L-1和40 μmol·L-1组外，其余各化合物各个浓度组均能不同程度的促进HepG2细胞糖消耗。

3.3 藤茶主要成分对胰岛素抵抗HepG2细胞内ROS、MDA、SOD、CAT、LD和ATP水平的影响

由表2可知，模型组ROS、MDA、LD含量较正常对照组显著升高，SOD、CAT活性及ATP水平与正常对照组相比显著降低。与模型组相比，没食子酸、二氢槲皮素及杨梅苷(20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)处理后ROS含量显著降低；二氢杨梅素和二氢槲皮素(10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)、没食子酸(20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)、杨梅素及杨梅苷各浓度组MDA含量也明显下降；与此同时，二氢杨梅素和杨梅苷(10μmol·L-1、20μmol·L-1、40 μmol·L-1)、没食子酸和杨梅素(20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)及二氢槲皮素各浓度组SOD活性较模型组有显著提高；二氢杨梅素(10 μmol·L-1、20 μmol·L-1)、杨梅素(10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)、没食子酸、二氢槲皮素及杨梅苷各浓度组的CAT活性也显著上升；没食子酸和二氢槲皮各浓度组、杨梅素(40 μmol·L-1)及杨梅苷(20 μmol·L-1)LD含量显著降低；二氢杨梅素和没食子酸各浓度组、二氢槲皮素和杨梅素(20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)及杨梅苷(10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)ATP含量显著升高。

表1 藤茶主要成分对IR-HepG2细胞糖消耗影响

注：与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01；与正常对照组相比，##P<0.01。

表2 藤茶主要成分对胰岛素抵抗HepG2细胞内ROS、MDA、SOD、CAT、LD和ATP水平的影响

注：与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01；与正常对照组相比，##P<0.01。

4 结论

机体发生氧化应激损伤，细胞内ROS水平升高；MDA作为脂质过氧化最重要的产物之一，可以反映体内脂质过氧化的程度，间接地反映细胞氧化损伤程度；而体内的抗氧化系统，如SOD、CAT等则能减少氧自由基对细胞的损伤，它们活性的高低反映机体的抗氧化能力[6]。胰岛素抵抗引起细胞内葡萄糖无氧酵解的过程增强，乳酸生成增加。乳酸在细胞内积聚，会导致细胞渗透压增高，线粒体肿胀和破裂，影响线粒体呼吸功能而发生能量代谢障碍。高糖使细胞内乳酸和氧自由基与脂质过氧化物生成增加，又会损伤线粒体的能量代谢，细胞内ATP水平下降[14，15]。本实验以高糖诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗，结果表明，在有效浓度范围内，各样品对细胞存活率无显著影响。高糖可以引起细胞内ROS、MDA水平增高，SOD、CAT活性下降，其氧化/抗氧化体系的稳态失衡，而没食子酸、二氢槲皮素和杨梅苷能显著降低细胞内的ROS水平，二氢杨梅素、没食子酸、二氢槲皮素、杨梅素和杨梅苷均能明显增加胰岛素抵抗HepG2细胞SOD、CAT的活性，降低MDA水平。本研究经过高糖造模后，细胞内液乳酸含量明显增加，而损伤前给予供试样品预处理可抑制乳酸含量的增加。

以上研究结果提示藤茶可能通过降低细胞内活性氧水平、抑制脂质过氧化反应及提高细胞内抗氧化酶的活性来减少自由基对细胞的损伤，增加细胞的抗氧化功能，减轻细胞的氧化应激，从而预防胰岛素抵抗。同时，可能也与减轻细胞代谢性酸中毒，提高ATP水平，改善细胞能量代谢有关。

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EffectsofmaincompoundsfromAmpelosisgrossedentataonoxidativestressininsulin-resistantHepG2cells

PANHuimin1，2，JIANGBaoping1，2，LELiang1，XIAOWei1，2，XULijia1，2*，XIAOPeigen1，2

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences，PekingUnionMedicalCollege，Beijing100093，China； 2.KeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandResourcesUtilizationofChineseHerbalMedicine，MinistryofEducation，Beijing100193，China)

Objective：To investigate the influence of the main compounds：dihydromyricetin，gallic acid，dihydroquercetin，myricetin and myricitrin fromAmpelopsisgrossedentataon glucose consumption，ROS，MAD，SOD，CAT，LD and ATP in insulin-resistant HepG2 cells.Methods：HepG2 cells were divided into control group，model group and sample groups.Insulin-resistant cells model was induced by high concentration of glucose (55 mmol·L-1).The proliferation of cells were detected by 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenylterazolium bromide (MTT) assay.The contents of glucose in culture supematant were measured by the glucose oxidase peroxides (GOD) method. The contents of MDA，SOD，CAT and LD were observed by spectrophotometric method.The contents of ROS and ATP were analyzed on a fluorescence microplate.Results：The five compounds had little impact on the cells proliferation within the range of effective concentration.The five compounds increased the glucose consumption significantly in insulin-resistant cells.After treated with the five compounds，the contents of SOD，CAT and ATP increased significantly，while that of MDA decreased.Dihydroquercetin，gallic acid and myricitrin were able to reduce the contents of ROS and LD significantly.Meanwhile，the content of LD also could be reduced significantly by myricetin.Conclusion：Dihydromyricetin，gallic acid，dihydroquercetin，myricetin and myricitrin fromA.grossedentatacan alleviate oxidative stress in the insulin-resistant HepG2 cells.

Ampelosisgrossedentata；HepG2 cells；insulin-resistant；oxidative stress

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.3.019

2015-01-07)

国家自然科学基金面上项目(81274188)：四种别样茶改善胰岛素抵抗的物质基础和作用机制研究

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许利嘉，副研究员，博士，研究方向：别样茶的物质基础研究；TEL：010-57833165 E-mail：xulijia@hotmail.com