滇黄精及其活性成分群对α-糖苷酶活性抑制作用研究△

陆建美，闫鸿丽，王艳芳，胡雪岩，俞捷，尚云青

(云南中医学院 药学院，云南 昆明 650500)

·基础研究·

滇黄精及其活性成分群对α-糖苷酶活性抑制作用研究△

陆建美，闫鸿丽，王艳芳，胡雪岩，俞捷*，尚云青*

(云南中医学院 药学院，云南 昆明 650500)

目的：探讨滇黄精及其活性成分群对α-葡萄糖苷酶活性的抑制。方法：以4-硝基酚α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物，研究滇黄精不同提取成分对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。结果：滇黄精及其不同提取物对α-葡萄糖苷酶都具有一定的抑制作用，其中小剂量的滇黄精总皂苷抑制率最明显，抑制率为34.2%；滇黄精生水提液次之，抑制率为27.7%；而其制水提液及其总多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用不明显。结论：滇黄精总皂苷具有明显的α-葡萄糖苷酶抑制活性，可能为滇黄精降糖活性的主要物质基础。

滇黄精；总皂苷；α-葡萄糖苷酶

黄精是我国重要的药食两用资源，《中华人民共和国药典》2010版收载黄精为百合科植物滇黄精PolygonatumkingianumColl.Et Hemsl.、黄精PolygonatumsibiricumRed.或多花黄精PolygonatumcyrtonemaHua的干燥根茎。分别习称“大黄精”“鸡头黄精”“姜形黄精”。《中华人民共和国药典》规定的三个黄精中，滇黄精产量大，市场份额大，主产于云南、四川、贵州、广西等省。云南为滇黄精的道地产地[1]，蕴藏量大，品质优良。《滇南本草》《云南植物志》等均有滇黄精药用记载，其为重要的“云药”品种之一，具有广泛的临床应用基础及良好的开发前景。

黄精主要含有多糖、低聚糖、黄精皂苷、氨基酸、黄酮及微量元素等成分，有抗衰老、增强免疫力、降血糖、降血脂、抗菌、抗病毒等作用，临床上主要用于降血糖。据报道，滇黄精提取物对多种原因导致的高血糖小鼠有降糖作用[2]。黄精多糖能够降低肾上腺素诱发的高血糖小鼠的血糖值，同时能降低肾上腺素模型小鼠肝脏中环磷酸腺苷(cAMP)的含量[3]；黄精甲醇提取物在降低链脲佐菌素诱导的高血糖小鼠血糖的同时不改变胰岛素水平，还有抑制肾上腺素诱发高血糖小鼠血糖的作用[4]。

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)是一类能够从含有α-葡萄糖苷键底物的非还原端催化水解α-葡萄糖基的酶，包括位于小肠腔的α-淀粉酶、小肠上段刷状缘的麦芽糖酶、α-糊精酶和蔗糖酶等。食物中的碳水化合物经相关酶作用后和蔗糖一起，通过蔗糖酶等α-糖苷酶水解作用生成葡萄糖、半乳糖和果糖，经肠壁细胞吸收而被机体利用。α-葡萄糖苷酶与糖尿病的发生、发展及机体糖代谢紊乱密切相关[5]。德国拜耳公司于20世纪70年代研制的α-葡萄糖苷酶抑制剂，主要通过抑制α-葡萄糖苷酶活性，从而降低餐后的血糖水平。口服α-葡萄糖苷酶抑制剂后，小肠上段的糖苷酶活性大部分被抑制，寡糖和双糖的吸收减慢，有的可减少80%。此类药物对Ⅰ、Ⅱ型糖尿病均适用，也可以与其他口服降糖药或胰岛素联合使用。目前市场上销售的用于治疗糖尿病的α-葡萄糖苷酶抑制剂有阿卡波糖(拜糖平)、伏格列波糖(倍欣)、米格列醇。经临床应用，上述药物均取得了较好的疗效，被认为是Ⅱ型糖尿病的首选药和Ⅰ型糖尿病胰岛素治疗的辅助药物[6]。

滇黄精具有良好的调节糖代谢活性功能，已在临床上广泛应用。目前对滇黄精降糖活性成分及作用靶点的研究较少，且其降糖的活性成分及作用机理均不明确，缺乏对除滇黄精多糖外其余成分类群的活性研究，其质量控制方法也不完善，只根据总多糖含量难以评价滇黄精质量。为此，本研究从滇黄精不同提取物对α-葡萄糖苷酶的作用情况入手，探讨和比较其活性成分群的α-葡萄糖苷酶抑制作用，筛选出滇黄精降血糖的主要活性物质，为其降糖机制的后续研究提供参考。

1 方法

1.l 仪器与试药

1.1.1 仪器 UV-2100型分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；HH-6型数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；CP225D型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.1.2 试药α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)；4-硝基酚α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG，批号：101324963，CAS：3767-28-0)；阿卡波糖(拜耳医药保健有限公司)；胎牛血清(批号：NXA0544)；其余化学试剂均为分析纯。

1.2 试剂配制

酶溶液：精密称取1.002 1 gα-葡萄糖苷酶冻干粉，用0.1 mol·L-1PBS溶液溶解，加入0.2 mL的胎牛血清，再用0.1 mol·L-1PBS定容到100 mL，配成浓度为0.15 U·mL-1的溶液。

pNPG：用0.1 mol·L-1PBS溶液将pNPG粉末溶解，配制成浓度为20 mmol·L的溶液。

阿卡波糖：取2片(50 mg/片)阿卡波糖研碎，溶于1 mL PBS溶液中，5000 rpm离心2 min，取上清液，得质量浓度为100 mg·mL-1的溶液。

1.3 滇黄精的炮制及活性成分群的制备

1.3.1 炮制方法 依据《中华人民共和国药典》2010版记载，将鲜滇黄精洗净，切成厚片，置蒸制器内，蒸至黄精片成滋润黑色，烘干，即得蒸制滇黄精。

1.3.2 水提液的制备 将滇黄精粉碎，加入20倍量的水，分2次提取，每次1.5 h，浓缩到适当浓度，即得滇黄精水提液。

1.3.3总皂苷的提取 将滇黄精粉碎，用10倍量的80%乙醇水浴提取1.5 h，提取2次，减压回收乙醇，得浸膏，分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，最后回收正丁醇，得浸膏，挥干正丁醇，冷冻干燥后即得总皂苷。

1.3.4 黄精多糖的提取 将滇黄精粗粉分别用8倍量和6倍量蒸馏水提取，合并滤液，减压浓缩得浸膏(每mL含1 g生药)，用4倍量的无水乙醇沉淀后，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，用sevage法去蛋白，透析，冷冻干燥，即得较纯的多糖。

1.4 反应体系优化

在磷酸钾缓冲液(pH 6.8)体系中，反应温度为37 ℃，以pNPG为反应底物，加入葡萄糖苷酶，以碳酸钠(Na2CO3)为终止液。pNPG溶液无色，但经葡萄糖苷酶水解，释放出对硝基苯酚(pNP)，pNP在碱性条件下呈黄绿色，在400 nm处有最大吸收。当加入α-糖苷酶抑制剂时，可以抑制α-糖苷酶的活性，减少pNP的释放，因此可以通过吸光度的变化来测定抑制活性。调整α-糖苷酶和底物pNPG的浓度，糖苷酶浓度固定后，当底物浓度增加而吸光度值无明显变化时，确定其为最佳反应体系。

1.5 阳性对照药物最大抑制浓度的确定

取不同体积的阿卡波糖溶液，加人到反应体系中，空白对照组加入相同体积的PBS溶液(浓度为0.1 mol·L-1)，其他方法同酶活力测定，确定阿卡波糖对α-糖苷酶的最大抑制浓度及抑制率。

1.6 酶活力单位定义及抑制率计算

酶活力单位：37 ℃、pH 6.8条件下，每分钟水解底物所产生1 mol pNP的酶量，规定为一个酶活力单位(U)。

酶抑制活力单位：在相同条件下降低1个酶活力单位所需的抑制剂的量为一个抑制剂活力。

抑制率=(抑制剂活力/原酶活力)×100%

简化公式：抑制率=(A空白-A样品)/A空白×100%

(A空白为未加样品体系的吸光度，A样品为加入样品体系的吸光度)

2 结果

2.1 最佳反应体系的确定

确定反应体系中酶的量后，随着pNPG体积的增加，pNP的释放随之增加到最高值，确定其为酶与pNPG的最佳反应体系。见图1。

最终反应体系确定：取pH 6.8磷酸盐缓冲液725 μL，待测样品溶液10 μL，α-葡萄糖苷酶(0.15 U·mL-1)100 μL，混匀，不加待测样品溶液作为空白对照(pH 6.8磷酸盐缓冲液补足)，以不加酶溶液的反应体系作为溶剂系统调零，37 ℃恒温水浴保温10 min，再向反应体系中加入175 μL 4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷，恒温10 min后，立即加入2 mL浓度为0.1 mol·L-1的Na2CO3溶液终止反应。

2.2 阳性药的最大抑制率

反应体系确定酶浓度以后，加入的阿卡波糖在体系中的质量浓度为0.5 mg·mL-1时，抑制率为63.6%，当加入的阿卡波糖质量浓度大于0.5 mg·mL-1时，抑制作用无明显增加。因此，当阿卡波糖的质量浓度为0.5 mg·mL-1时具有最大抑制率，作为阳性对照药物的最佳浓度。结果见图2。

图1 pNPG体积-吸光度曲线

图2 阿卡波糖浓度-抑制率曲线

2.3 滇黄精水提液及其不同组分对α-葡萄糖苷酶的抑制率作用

与制滇黄精作用相比，生滇黄精水提液对α-葡萄糖苷酶有明显的抑制作用，抑制率为27.7%，随着浓度的增加，制滇黄精水提液作用反而有所下降，见表1。此外，活性成分群总皂苷有明显的抑制作用，浓度较小(质量浓度为4 mg·mL-1)的滇黄精总皂苷抑制率为34.2%，见表2，黄精多糖抑制作用较弱，见表3。

表1 滇黄精水提液的α-葡萄糖苷酶抑制率(x±SD)

表2 滇黄精总皂苷的α-葡萄糖苷酶抑制率(x±SD)

表3 滇黄精总多糖的α-葡萄糖苷酶抑制率(x±SD)

3 讨论

研究结果显示，滇黄精及其不同提取物对α-糖苷酶都有一定的抑制作用，这与滇黄精具有降血糖的功能相符。相对于其他组分，滇黄精总皂苷的抑制作用更明显，且成量效关系，质量浓度为4 mg·mL-1时总皂苷有明显的抑制作用。因此，黄精总皂苷可能通过参与抑制体内小肠α-糖苷酶的作用而具有降低血糖的作用，其可作为黄精抑制α-糖苷酶的主要成分进一步进行体内研究。

可作为α-糖苷酶抑制剂的药物主要源于微生物发酵液、天然植物提取以及人工化学合成的有机物[8]，目前已用于临床的α-糖苷酶抑制剂类药物主要有排气增加、腹泻、肠鸣、腹痛等副作用[9]，还有丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)升高以及导致肝肾损伤等报道[10]。而从天然植物中寻找新的具有更低毒副作用、高效的α-糖苷酶抑制剂一直是各国研究的热点。

基于滇黄精总皂苷体外抑制α-糖苷酶的作用，以及滇黄精作为药食两用且无毒副作用，从滇黄精中提取的总皂苷可作为黄精降糖作用的主要成分，并且需要进一步研究其体内降糖机制。

[1] 陈兴荣，王成军，杨永寿.滇黄精抗衰老保健食品的研究与开发[J].中国民族民间医药，2009(21)：1-3.

[2] 陈兴荣，赖泳，王成军.滇黄精对诱导性高血糖小鼠血糖影响的实验研究[J].时珍国医国药，2010，21(12)：3163-3164.

[3] 王红玲，张渝侯，洪艳，等.黄精多糖对小鼠血糖水平的影响及机理初探[J].儿科药学杂志，2002，8(1)：14-15.

[4] Kato A，Miura T.Hypoglycemic activity of Polygonati Rhizoma in nomal and diabetic mice[J].Biol Pham Bull，1993，16(11)：18-20.

[5] Horii S，Fukase H.Synthesis ofα-glucosidase inhibitiory activity of N-substituted valiolsmine derivatives as potential oral antidiabetic agents[J].J Med Chem，1986，29(6)：1038-1046.

[6] 刘霞，冯长根.酶抑制剂在抗糖尿病药物中的应是研究[J].中国药学杂志，2003，38(2)：89-91.

[7] Matsui T，Shimada M，Saito N.α-Glucosidase inhibition assay in an enzyme-immobilized amino-micrioplate[J].Anal Sci，2009，25(4)：559-562.

[8] Asano N.Glycosidase inhibition：update and perspectives on practical use[J].Glycobio，2003：13(10)：93-104.

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[10] Van de Laar F A，Lucassen P L，Akkermans R P.Alpha-glucosidase inhibitors for patients with type 2 diabetes results from a Cochrane systematic review and meta-analysis[J].Diabetes Care，2005，28(1)：154-63.

InhibitoryEffectofPolygonatumkingianumRhizomaanditsActiveIngredientGroupsonα-Glucosidase

LUJianmei，YANHongli，WANGYanfang，HUXueyan，YUJie*，SHANGYunqing*

(FacultyofPharmaceuticalScience，YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Kunming，650500，YunnanProvince，China)

Objective：To study the inhibitory effect ofPolygonatumkingianumrhizomes and its active ingredient groups on theα-glucosidase.Methods：Invitroα-glucosidase inhibition rate was tested by using 4-nitrophenol-α-D-glucopyranoside(pNPG)as substrate.Results：The inhibition rate of low dose total saponin was 34.2%，and that ofP.kingianumrhizomes water extraction was 27.7%.However，no inhibitory effect was found in total polysaccharide group.Moreover，the inhibition effect vanished after the crude drug was processed.Conclusion：Total saponin might be one of the active substances ofPolygonatumrhizomato reduce blood sugar.

Polygonatumkingianum；total saponin；α-glucosidase

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.3.003

2014-08-28)

云南省教育厅自然科学研究基金(2014J067)；云南省大学生创新创业训练计划项目基金(31070101814)

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俞捷，副教授，硕士生导师，研究方向：药理学和药物分析学；Tel：(86-871)5918055，E-mail：cz.yujie@gmail.com 尚云青，副教授，研究方向：食品药品科学；Tel：(86-871)5918033，E-mail：shyq86@sina.com